Immunohistochemical and Molecular Biological Investigations Regarding the Pathogenesis of Extrahepatic Biliary Atresia

Abstract

Introduction

The pathogenetic model for biliary atresia presently most favored is that EHBA is the result of a peri- or postnatal bile duct lesion. Several authors demonstrated inflammatory infiltrations in the mesenchymal areas of the liver and thus concluded an infectious genesis. An association of rota-, reo- (and CMV) virus infection with EHBA was suspected, but the presence of these viruses in EHBA could not be reproduced. In view of this controversial debate we found it to be indicated to investigate tissue blocks from the porta hepatis and liver biopsies in children with EHBA by histo- and immunohistochemistry for the quality and quantity of leukocyte infiltrations.

Methods

31 tissue excidates of the porta hepatis were gained on the occasion of hepatoportoenterostomy, fixed in 4 % buffered formalin and embedded in paraffin. The presence of leukocyte infiltrations and their subpopulations was demonstrated by histochemical reactions and immunohistochemical staining methods using specific antibodies against surface markers. The number of leukocytes and their subpopulations was counted in three different regions of the porta hepatis, the obliterated extrahepatic bile duct, the fibrous mass of the porta hepatis and the transition zone between the fibrous mass and liver parenchyma. A statistical analysis was done.

Results

In EHBA, leukocyte infiltrations consist mainly of macrophages. Antigen-presenting cells and lymphatic cells play a minor role. Lymphatic cells could only be detected in 6 out of 31 tissue preparations. Antigen-presenting cells could only be detected via anti-F13a antibody which shows cross-reactivities, i.e. against macrophages and embryonal tissue. Evaluating the density of leukocyte infiltrations with regard to the different anatomical regions of the porta hepatis we could demonstrate that leukocyte infiltrations are scarce around the rudiment of the bile duct whereas the highest leukocyte density could be found in the fibrous mass of the porta hepatis and the intrahepatic fibrous septs interconnecting the fibrous mass of the porta hepatis with liver parenchyma. Liver parenchyma was mainly free of leukocyte infiltrations with the exception of neutrophilic granulocytes. Regardless of the subpopulations, leukocytes were mainly arranged around the bile ducts of the fibrotic septa.

Conclusions

Most tissue preparations from children operated on during the 4th-8th week of life show only small leukocyte infiltrations and in the majority of cases no immunocompetent lymphocytes. This leads to the conclusion that a virus infection as an underlying cause for EHBA is very unlikely. Most probably, the observed leukocyte infiltrations are due to an unspecific phagocytotic activity. Comparing our results to reports from Hadchouel et al ([9]) and Landing et al ([12]) led us to believe that a pathologic immunoreaction with a possible defective antigen elimination could also be considered as a reason for EHBA.

Résumé

Introduction

L'atrésie des voies biliaires extrahépatiques est la conséquence d'une lésion péri- ou postnatale des voies biliaires. Plusieurs auteurs ont mis en évidence une infiltration inflammatoire du mésenchyme hépatique et ont conclu à une origine infectieuse. Si une association de rotavirus et de réovirus (et du cytomégalovirus) avec l'átresie des voies biliaires extrahépatiques est suspectée, la présence de ces virus n'a pas été démontrée. En raison des débats contradictoires, il nous semble important d'effectuer une étude histologique et immunohistochimique qualitative et quantitative de l'infiltration leucocytaire des résections portales et des biopsies hépatiques obtenues chez les enfants atteints d'atrésie des voies biliaires extrahépatiques.

Méthodes

L'étude porte sur 31 prélèvements de porta hepatis obtenus lors d'une hépatoportoentérostomie. Les prélèvements étaient fixés au formol à 4 % et inclus en paraffine. L'infiltration leucocytaire était mise en évidence par des réactions histochimiques et des méthodes de coloration immunohistochimiques utilisant des anticorps spécifiques des marqueurs de surface. Le nombre de leucocytes et leurs sous-populations étaient comptés dans trois de la porta hepatis: la partie fermée du canal biliaire extrahépatique, la masse fibreuse de la porta hepatis et la zone transitionnelle entre la masse fibreuse et le parenchyme hépatique. Une analyse statistique était réalisée.

Résultats

Les macrophages prédominaient dans l'infiltration leucocytaire avec un nombre plus faible de cellules présentatrices d'antigènes et de lymphocytes qui n'étaient observés que dans 6 des 36 préparations. Les cellules présentatrices d'anticorps étaient mises en évidence uniquement par des anticorps anti-F13a, montrant une réaction croisée contre les macrophages et le tissu embryonnaire. L'évaluation de la densité de l'infiltration leucocytaire en fonction des différentes régions anatomiques de la porta hepatis montrait que l'infiltration leucocytaire était peu importante autour des résidus des canaux biliaires alors que la densité des leucocytes était beaucoup plus élevée dans la masse fibreuse de la porta hepatis et le parenchyme hépatique. Ce dernier était essentiellement sans infiltration leucocytaire, avec l'exception de granulocytes neutrophiles. En ce qui concerne les sous-populations leucocytaires, elles étaient principalement regroupées autour des canaux biliaires des éléments fibreux.

Conclusion

Les préparations de la plupart des tissus des enfants opérés de la 4 ^ème à la 8 ^ème semaine de vie montrent seulement une infiltration leucocytaire modérée. Dans la majorité des cas, il n'y a pas de lymphocytes immunocompétents. En conséquence, il est hautement improbable qu'une infection virale soit la cause de l'atrésie des voies biliaires. L'infiltration leucocytaire observée est probablement due à une activité phagocytaire non- spécifique. La comparaison de nos résultats à ceux rapportés par Hadchouel et al (9) et Landing et al (12) suggère que la cause de l'atrésie des voies biliaires serait une réaction immune pathologique.

Resumen

Introducción

El modelo patogénico de atresia biliar más plausible en la actualidad es que se deba a una lesión peri o postnatal de la región ductal. Varios autores han demostrado infiltraciones inflamatorias de las áreas mesenquimatosas del hígado y han concluído que podrían tener origen infeccioso. La asociación de infección por rotavirus, reovirus o citomegalovirus con EHBA ha sido sospechada pero nunca se ha podido reproducir la presencia de estos virus en la enfermedad. Hemos considerado indicado investigar los bloques de tejido de la porta hepatis y las biopsia hepáticas de niños con atresias de vías biliares mediante histo e inmunohistoquímica con el fin de estudiar la calidad y cantidad de infiltrados leucocíticos.

Métodos

Se fijaron en formol tamponado al 4 % 21 especímenes de la porta hepatis obtenidos en el curso de una hepatoportoenterostomía y se incluyeron en parafina. La presencia de infiltrados leucocíticos y sus subpoblaciones fue investigada por reacciones histoquímicas y métodos de tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos contra los marcadores de superficie. El número de leucocitos y de sus subpoblaciones se contó en tres regiones diferentes de la porta hepatis: el conducto biliar extrahepático obliterado, la masa fibrosa de la porta hepatis y la zona de transición entre la masa fibrosa y el parénquima hepático. Se realizó un análisis estadístico.

Resultados

En la EHDA la infiltración leucocítica consiste fundamentalmente en macrófagos. Las células presentadoras de antígenos y las celulas linfáticas juegan un papel menor. Las células linfáticas pueden ser detectadas solamente en 6 de las 31 preparaciones. Las células presentadoras de antígenos pudieron ser detectadas solamente mediante un anticuerpo anti F13a que muestra reactividad cruzada contra macrófagos y tejido embrionario. Evaluando la densidad del infiltrado leucocítico con respecto a las regiones anatómicas diferente de la porta hepatis pudimos demostrar que este era escaso alrededor del rudimiento del conducto biliar mientras que la mayor densidad pudo ser encontrada en la masa fibrosa y en los septos fibrosos que interconectan ésta con el parénquima hepático. Este último estaba libre de infiltrados leucocíticos con excepción de granulocitos neutrófilos. Todas las subpoblaciones leucocitarias estaban distribuídas alrededor de los conductos biliares y de los septos fibrosos.

Conclusiones

La mayoría de las preparaciones tisulares de niños operados durante la cuarta a la octava semana de vida muestran solamente pequeños infiltrados leucocíticos en la mayoría de los casos sin linfocitos inmunocompetentes. Esto sugiere que es poco plausible una infección viral como factor etiológico. Más probablemente los infiltrados leucocíticos se deben a una actividad fagocítica inespecífica. Comparando los resultados con los de Hadchouel y cols. y Landing, es posible que la causa de la EHBA sea una inmunoreacción patológica con eliminación defectuosa del antígeno.

Zusammenfassung

Einführung

Überlegungen zur Pathogenese der Extrahepatischen Gallengangsatresie (EHGA) konzentrieren sich auf drei ätiologische Modelle. Die erste Theorie beschreibt die Gallengangsatresie als Resultat einer peri- oder postnatalen Gallengangsdestruktion durch virale, toxische, vaskuläre oder immunpathologische Mechanismen. Die zweite geht von einer embryonalen Fehlbildung der Gallengänge aus. Die dritte postuliert eine genetische Disposition. Da in den mesenchymalen Leberarealen entzündliche Infiltrationen nachgewiesen werden können, wird eine infektiöse Genese für wahrscheinlich gehalten. Trotzdem konnte bis jetzt keine infektiöse Ursache bestätigt werden, auch virale Infektionen wurden bisher nicht valide bewiesen. Deshalb wurden zum Beweis oder Ausschluss einer viralen Ursache Leberpfortenexzidate und Leberbiopsien mit immunhistochemischen Methoden zum qualitativen Nachweis leukozytärer Infiltrationen untersucht. Mit der Zusammensetzung der leukozytären Subpopulationen soll die Wahrscheinlichkeit einer viralen Infektion eingegrenzt werden.

Methoden

31 intakte Leberpfortenexzidate wurden in 4 %igem gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die leukozytären Subpopulationen wurden mit Antikörpern gegen Oberflächenmarker dargestellt. Die Leukozyten und ihre Subpopulationen wurden in drei verschiedenen Regionen der Leberpforte ausgezählt, im obliterierten extrahepatischen Gallengang, in der fibrösen Leberpforte und in der Übergangszone der Leberpforte zum Leberparenchym. Mit statistischen Verfahren wurden Signifikanzen berechnet.

Ergebnisse

Die leukozytären Infiltrate bei Gallengangsatresie bestehen hauptsächlich aus Makrophagen. Antigenpräsentierende Zellen und Lymphozyten spielen nur eine untergeordnete Rolle. Lymphozytäre Zellen konnten nur in 6 von 31 Präparaten nachgewiesen werden, zudem nur in geringer Anzahl. Das Rudiment des Gallenganges war nur mit sehr geringen leukozytären Infiltraten durchsetzt. Die höchste Infiltration mit Leukozyten konnte in der fibrösen Platte der Leberpforte und in den intrahepatischen fibrösen Septen, die die Leberpforte mit dem Leberparenchym verbinden, nachgewiesen werden. Das Leberparenchym selbst war weitgehend frei von leukozytären Infiltraten. In den Glissonschen Dreiecken waren die Leukozyten hauptsächlich um die Gallengänge angeordnet.

Schlussfolgerungen

Die meisten Präparate von Kindern, die in der 4. bis 6. Lebenswoche operiert wurden, zeigten nur geringe leukozytäre Infiltrate. Die leukozytären Infiltrate waren in der Regel frei von immunkompetenten Lymphozyten. Dieses Ergebnis führt zum Schluss, dass eine virale Infektion als Ursache der EHGA sehr unwahrscheinlich ist.

Key words

Extrahepatic biliary atresia - pathogenesis - viral genesis - immunology

Mots-clés

Atrésie des voies biliaires extrahépatiques - pathogénèse - origine virale - immunologie

Palabras clave

Atresia biliar extrahepática - patogenia - etiología vírica - inmunología

Schlüsselwörter

Extrahepatische Gallengangsatresie - Pathogenese - virale Genese - Immunologie

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