BAL beim Nager

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Einleitung: Möglichkeiten der Abbildung des alveolären oder bronchialen Milieus

Die broncho-alveoläre Lavage hat sich in der Human-Pneumologie als diagnostisches Hilfsmittel aufgrund der Kombination von minimalem Risiko und hoher Aussagekraft in verschiedenen klinischen Situationen fest etabliert [1]. Im Tierversuch wird die BAL im Gegensatz zur klinischen Situation fast ausschließlich am terminal narkotisierten oder euthanasierten Tier angewandt und konkurriert deshalb mit invasiveren Methoden wie der Histologie, die zum Verständnis pathologischer Prozesse unersetzbar ist und dabei komplexe räumliche und qualitative Aufschlüsse bietet. Hier stehen uns heute eine Fülle von alternativen Untersuchungsmethoden zur Verfügung, einige von ihnen sind in Tab. [1] gezeigt. Die Methodenwahl sollte die eindeutige Beantwortung der gestellten wissenschaftlichen Frage[n] erlauben, und sie sollte praktikabel und finanzierbar sein. Praktikabel und finanzierbar ist die BAL, aber was leistet sie? Mithilfe der BAL wird das alveoläre - und in Grenzen auch das bronchiale - Milieu bezüglich seiner zellulären und nicht-zellulären Komponenten darstellbar. Das gilt aber nicht für interstitielle oder vaskuläre Veränderungen. In einem Asthmamodell kann z. B. ein entzündliches Infiltrat lediglich submukös sein oder sich bis in die Mucosa ausdehnen; nur Letzteres wird in der BAL erfasst.

Tab. 1 Zusammenfassende Übersicht von ausgewählten Möglichkeiten zur Beurteilung des alveolären oder bronchialen Milieus

1.	Histologie und Immunhistologie inkl. Morphometrie, elektronenmikroskopischer Verfahren, In-situ-Hybridisierung
2.	Lungenepithel-Gewinnung mittels Zytologie-Bürste
3.	Lungenfunktionsmessung in vivo und/oder ex vivo
4.	Metabolitenmessungen ex vivo, z. B. mittels isoliert perfundierter Nagerlunge (Ratte, Maus, Kaninchen…)
5.	Lungen-Mikroschnitt-Technik
6.	Atemkondensat
7.	broncho-alveoläre Lavage
8.	Ödemflüssigkeit, z. B. bei Patienten mit akutem Lungenschaden, Lungenödem
9.	Sputum (Mensch)
10.	Homogenatmessungen aus der Lunge oder aus Lungenteilgewebe
11.	Methoden der klinischen Bildgebung (Röntgenbild, Computertomographie, MRI, PET) etc.

Die broncho-alveoläre Lavage (BAL)

Die BAL ist eine Methode zur Gewinnung zellulärer und azellulärer Komponenten der epithelialen Flüssigkeit, die im Respirationstrakt auf den Epithelzellen liegt („epithelial lining fluid” [ELF]). Im Rahmen von pathologischen Prozessen wie bronchialer Entzündung, Pneumonie oder akutem Lungenschaden kann sich die ELF ganz grundlegend in ihrer zellulären und azellulären Zusammensetzung verändern. Sie kann bei Lungenödem, z. B. bei akutem Lungenschaden im humanmedizinischen Bereich in kleiner Menge relativ einfach gewonnen werden [2]; beim Kleintier dürfte die gewonnene Menge meist prohibitiv klein sein. Die Instillation von meist ungepufferter 0,9 %iger NaCl-Lösung über die großen Luftwege bis in die Alveolen führt zur Mischung der „epithelial lining fluid” mit dem instillierten Medium. Oftmals wird EDTA zum Binden von Ca²⁺ und Mg²⁺ eingesetzt, um die Calcium-abhängige Bindung von adhärenten Zellen zu lösen und dadurch die Zellausbeute der BAL zu erhöhen. In einer Studie mit calcium-freiem Puffer, aber ohne EDTA, konnten 42 % aller Alveolarmakrophagen durch die BAL nicht ausgewaschen werden [3]. Angemerkt sei, dass bei der Maus die Körperflüssigkeit, wie Plasma, in der Größenordnung von 10 - 15 % höher osmolar ist als bei der Spezies Mensch [4]; ob BAL mit entsprechend eingestellter NaCl-Lösung Vorteile bietet, ist unbekannt. Durch vorsichtige Rückgewinnung der Mischung erhalten wir die BAL-Flüssigkeit mit ihren zellulären und azellulären Bestandteilen. Bei der Rückgewinnung empfiehlt es sich, möglichst schonend vorzugehen, das heißt, nicht mit zu großem Unterdruck zu saugen, sondern nach moderatem Saugen mit der Spritze lieber die Schwerkraft nutzend die Flüssigkeit aus der Lunge laufen zu lassen, gegebenenfalls unter leichter Massage der Lunge bzw. des Thorax.

Die „epithelial lining fluid” ist eine äußerst komplex zusammengesetzte dünne Flüssigkeitsschicht, die die luminale Oberfläche des (gesunden) Respirationstrakts überzieht. In den Alveolen dürfte sie nahezu die gesamte epitheliale Oberfläche und die dazugehörige extrem dünne Surfactant-Schicht bedecken. Immunglobuline, Komplementkomponenten, Albumin, α1-Antiprotease, α2-Makroglobulin, β2-Mikroglobulin, Lactoferrin, reduziertes Glutathion, die Vitamine A, C, D3 und E, verschiedene Eicosanoide und viele weitere Stoffe sind Bestandteile der ELF. Die ELF beschränkt sich nicht nur auf den Alveolarbereich, sondern ist auch in den Luftwegen vorhanden, wo sie bei Entzündungen wie Bronchitis auch akkumulieren kann [5]. Während einige Aspekte der ELF in den letzen Jahren klarer herausgearbeitet werden konnten, ist die Quantifizierung darin gelöster Stoffe so problematisch, dass sowohl im Nager-Tierversuch als auch klinisch beim Menschen meist darauf verzichtet wird [5]. Als grobe Richtlinie darf wahrscheinlich davon ausgegangen werden, dass durch die BAL eine Verdünnung der ELF auf ca. 1 % geschieht [5]. Somit dürften z. B. gemessene Zytokine und Metaboliten grob geschätzt in der ELF um einen Faktor 100 höher konzentriert sein als in der BAL-Flüssigkeit.

Praktische Aspekte der Durchführung der BAL bei Nagern

Im Folgenden werden verschiedene praktische Aspekte zur Durchführung der BAL beim Nager diskutiert. In unseren Ausführungen beziehen wir uns vor allem auf Arbeiten mit der Maus, da sie die am häufigsten verwendete Spezies ist.

BAL-Volumen, Durchgänge mit frischer Flüssigkeit versus repetitives Instillieren der gleichen Flüssigkeit

Im Vordergrund steht die Frage, wozu die BAL durchgeführt wird. Wird z. B. eine Mediator- oder Zytokin-Messung aus einem Überstand als wichtigster Parameter gemessen, so kann es sinnvoll sein, eine möglichst geringe Verdünnung des alveolären Milieus zu erreichen, so dass dann mit geringen Flüssigkeitsvolumina, z. B. in der Maus mit 2 × 250 µl PBS, lavagiert wird [6]. Eventuell spricht dies auch für die Verwendung des gleichen Instillats - vorausgesetzt, dass genügend Flüssigkeit zurückgewonnen wird - zur repetitiven Instillation (z. B. 4 Flüssigkeitsinstillationen, die jeweils mit dreimaliger Wiederholung lavagiert werden [7]). Steht das Gewinnen von Zellen im Vordergrund, kann repetitiv instilliert werden, z. B. in der Maus mit 8× 0,5 ml [8], 3 × 0,8 ml [9] oder 1 × 1,0 ml bis 6 bis 8 × 10 - 1,5 ml [10] [11] [12]. Anschließend kann für Mediator- oder Surfactantmessungen der erste BALF-Überstand verwendet werden [13]. Bei der Ratte werden entsprechend bis 5 × 5,0 oder gar 8 × 8,0 ml Instillat verwendet [14] [15]. Durch Abklemmen oder Ligieren eines Lungenhilus kann auch nur eine der beiden Lungen lavagiert werden und die andere für andere Aufarbeitungsarten wie Histologie, Homogenat-Gewinnung etc. benutzt werden. Die Methode der selektiven BAL durch Abklemmen/Ligieren am Hilus ist auch bei einseitigen Pathologien wie linksseitiger Ratten-Lungentransplantation [16], einseitigen Modellen warmer Ischämie, einseitiger Bestrahlung oder einseitiger Instillation einer Noxe sinnvoll.

Normierung der BAL

Prinzipiell ist es möglich, Zellzahl und Mediatorkonzentrationen in der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit (BALF) zu bestimmen. Leider treten dabei bisher ungelöste Probleme auf. Erstens ist die Lavage ein invasiver Prozess, der selbst die Ergebnisse beeinflussen und die Atemwegsepithelien leicht schädigen kann [3] [17]. Zweitens ist bis heute noch kein Marker gefunden worden, der es erlauben würde, zu unterscheiden, wie viel der gewonnenen BALF instilliert worden ist und wie viel davon bereits vorher in der Lunge war [1] [18] [19]. Aufgrund dieser Einschränkungen sollten Messungen in der BALF vorsichtig und eher als semi-quantitative Ergebnisse eingestuft werden. In jedem Falle ist es notwendig und sinnvoll, die „Recovery” anzugeben.

Die zurückgewonnene Flüssigkeitsfraktion, die aufgrund des Zieles, die gewonnenen Zellen mit dem Manöver nicht zu schädigen, meist durch vorsichtigen Sog durch eine Spritze gewonnen wird, beträgt grob zwischen 50 und 70 %. Da mit dünnen Spritzen mit sehr kleinen Stempeldurchmessern größere Drücke als mit größeren Spritzen generiert werden, benutzen wir bei der Maus relativ großstemplige gut laufende 2-ml-Spritzen, bei der Ratte 5-ml-Spritzen.

Sehr oft wird in Publikationen die Fraktion der zurückgewonnenen Flüssigkeit nicht angegeben. Ohne diese Angabe kann aber theoretisch nicht ausgeschlossen werden, dass Konzentrationsunterschiede zwischen Behandlungsgruppen nur auf einer unterschiedlichen „Recovery” beruhen, so dass Messungen in der BALF ohne die Angabe der „Recovery” schwierig interpretierbar sind.

Eine kürzlich erschienene Arbeit bei zwanzig Emphysempatienten zeigte, dass das computertomographisch quantifizierte Emphysem-Ausmaß, die CO-Diffusionskapazität und FEV₁/VC mit der BAL-Recovery korrelieren [20]. Ob sich dies bei Emphysem-Modellen in Nagern bestätigen wird, bleibt offen, da die BAL-Recovery beim Menschen mit Emphysem mit der ineffizienten so genannten Kollateralventilation zusammenhängen könnte, und weil sich die Emphysem-Architektur zumindest bei durch Proteaseinstillation generierten Emphysemen deutlich gegenüber derjenigen beim Raucher unterscheiden könnte.

Soll die BAL am exsanguinierten Nager erfolgen?

Exsanguination und Freiperfundieren des Herz-Lungenblocks von Blut sind erforderlich, um blutfreie Lungenhomogenate zu erhalten. Bezüglich der Beeinflussung der broncho-alveolären Lavage dürften sie nicht von zentraler Bedeutung sein. Konzeptuell schließt die Situation einer blutfrei perfundierten Lunge indessen weitergehend aus, dass größere Mengen Mediatoren aus dem Blutkompartiment artifiziell ins alveoläre Milieu gelangen.

Tracheotomie

Bei Mäusen ist für die Tracheotomie eine 18G- oder 20G-Kanüle geeignet, bei Ratten eine 14G-Kanüle (z. B. jeweils ein Venen- oder Arterienkatheter). Beim Menschen wird z. B. mit dem Bronchoskop mittels „Wedge”-Technik ein luft- und flüssigkeitsdichtes System zum Lavagieren hergestellt. Um ein luft- und flüssigkeitsdichtes System auch beim Nager herzustellen, ist die BAL bei kleinen Nagern mit Kathetern mit Cuff-Möglichkeit oder dem Erreichen einer Wedge-Position theoretisch möglich. Auch könnte bei Maus und Ratte eine BAL in vivo durchgeführt werden, was allerdings eine protrahierte mechanische Ventilation voraussetzt: Zumindest in Flüssigkeitsresorptionsstudien konnten wir erarbeiten, dass Mäuse bis zu 22,5 µl/g Körpermasse an instillierter Flüssigkeit vertragen [Hamacher und Lucas, unpubliziert]. Bei der BAL dürfen keine Glaspipetten eingesetzt werden, da Glas die Alveolarmakrophagen stark aktiviert.

Temperatur des Instillats, Temperaturbedingungen für die Aufbewahrung, Aufbewahrungszeit

Am besten wird die BAL mit steriler Lösung bei 4 °C, idealerweise am auspräparierten Lungenblock mit der Lunge auf Eis durchgeführt. Dadurch wird die Aktivierung der Alveolarmakrophagen und anderer Zellen während der Präparation minimiert. Aktivierung von Zellen während der Lavage kann zur Freisetzung von Mediatoren und damit zur Verfälschung von Messergebnissen führen.

Idealerweise sollte die BALF zügig aufbereitet werden. In den meisten Studien geschieht die Aufarbeitung innerhalb von einer Stunde, in klinischen Studien allerdings erst nach 4 h [1]. Eine so lange Standzeit ist nur dann unproblematisch, wenn einzig Zellzahl und -verteilung von Interesse sind; in diesem Fall kann die BAL-Flüssigkeit bei 4 °C gekühlt bis zu 24 h gelagert werden [21]. Da 0,9 % NaCl kein Nutrient für Zellen ist und die Zellviabilität das wichtigste Problem bei langzeitiger Aufbewahrung sein dürfte, kann Zellkulturmedium beigemischt werden, um die Viabilität konstant zu erhalten.

Gefäß und Mukus-Filtration

Für die Aufbewahrung und Verarbeitung sollten silikonisierte Röhrchen benutzt werden, um die Adhärenz der Zellen so weit wie möglich zu reduzieren (niemals Glas benutzen). Konische Röhrchen bieten den Vorteil, das Pellet beim Auftrennen von BAL-Überstand und zellulärer Fraktion exakter und verlustfreier abpipettieren zu können, was besonders bei Versuchen mit der Maus aufgrund der kleinen Überstandsmenge sinnvoll sein kann.

Wird in der Klinik normalerweise die BAL durch eine oder zwei dünne Lagen steriler Nylon- oder Baumwollgaze gefiltert [1], um beim Darstellen des alveolären Milieus so wenig Mukuspartikel wie möglich beizumischen, so wird dies im Tierversuch kaum angewendet. Da insbesondere eine „bronchiale Fraktion” der BAL dadurch unterrepräsentiert werden kann, sollte der Untersucher die Entscheidung über die Mukus-Filtration seinem Untersuchungsziel anpassen.

Untersuchung zellulärer Bestandteile

Idealerweise wird die Zellzahl aus dem unkonzentrierten Aliquot der gepoolten BAL ermittelt. Türk-Lösung wird oftmals zur Zählung benutzt [22] [23]. Die Zentrifugation und (vorsichtige) Resuspension ergeben neue Fehlermöglichkeiten [21], Verluste der Zellzahl pro Waschschritt von ungefähr 15 - 20 % werden genannt [1]. Dabei muss auch z. B. mittels Tryptanblau-Exklusion die Zell-Viabilität geprüft werden [12].

Zur Bestimmung der zellulären Zusammensetzung der BAL sind Cytospin-Präparate der Standard. Ziel dürfte meistens sein, 50 000 bis 100 000 Zellen pro Zytozentrifugen-Präparat zu erhalten. Indessen ist bei sehr knapper BAL-Menge auch eine Differenzierung bei weniger Zellen noch gut möglich. May-Grünwald-Giemsa-Färbungen werden dafür am häufigsten verwendet [8] [15] [24] [25] [26], außerdem Wright-Giemsa-Färbungen [27] oder Diff-Quick-Färbungen [6] [7] [10] [14] [22] [28] [29] [30] [31] [32] [33]. Ob luftgetrocknete oder fixierte Cytospin-Präparate verarbeitet werden sollen, hängt von den weiteren Aufarbeitungszielen ab. In unseren Händen hat sich für die Routineaufarbeitung zu Fragestellungen des akuten Lungenschadens die Lufttrocknung und Auszählung mittels May-Grünwald-Giemsa-Färbung bewährt.

Aufgrund der Zellzahl und der prozentualen Zusammensetzung der BAL lassen sich auch Absolutzahlen von Zellen pro ml BAL ausrechnen. Dabei dürfte die oft in einer Neubauer-Zählkammer durch direkte Mikroskopie bestimmte Zellzahl das kritischere, d. h. mit größerer Fehlermöglichkeit behaftete Maß sein. Ob automatisierte, auf die BAL der Tiere optimierte Hämocytometer genauer sind, bleibt zurzeit offen [28]. Selbstverständlich können z. B. insbesondere in Asthmamodellen weitere mit den BAL-Zellen angefertigte Cytospin-Färbungen [29] [34] oder die Zellbestimmung mittels Fluorescence-activated-cell-scanner (FACScan)-Technik [25] von hohem Interesse sein.

Azelluläre Bestandteile der BAL-Flüssigkeit

Das Spektrum azellulärer Bestandteile der BALF bzw. des BALF-Überstandes ist analog zum Blutplasma schier unendlich. Dies spiegelt sich z. B. in der Beschreibung der BALF als „Zytokin-Suppe” beim Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) oder in Proteomics-Befunden und zweidimensionalen Gel-Elektrophoresen [35] wider. Beim kleinen Nager besteht die Problematik der Mediatormessung aus quantitativ stark limitierten Flüssigkeitsmessungen. Dazu kann es notwendig sein, die Lavage-Flüssigkeit zu reduzieren, um eine unnötige Verdünnung eines interessierenden Mediators zu vermeiden. Moderne Multiplex-Messverfahren erlauben das Messen vieler Mediatoren gleichzeitig in geringen Probenmengen [36]. Bei der Messung von Mediatoren in der BALF ist immer auch das Phänomen der Kompartimentierung eines pathologischen Prozesses zu berücksichtigen [37] [38] [39], und sicherzustellen, dass Mediatoren in der BALF nicht etwa aus der systemischen Zirkulation stammen.

Bestimmungen des kapillären Lecks

Besonders bei Modellen mit akutem Lungenschaden kann die Quantifizierung der endothelialen und epithelialen Permeabilitätsstörung von Bedeutung sein. Die Dichtigkeit der aus endothelial-interstitieller und interstitiell-alveolärer Barriere bestehenden Alveolarwandschranke kann in vivo durch radionuklid-markierte Blutbestandteile gemessen werden, z. B. durch ¹³¹I-Albumin oder ¹²⁵I-Albumin [40]. Die Messung von Evans-Blau gebundenem Albumin korreliert sehr gut mit der Messung mit radioaktiv markiertem Albumin, und ist dieser Methode zumindest bei reinem Ödem bei der Quantifizierung der Plasma-Exsudation überlegen. Eine andere interessante Methode ist die Verwendung von humanem Serumalbumin [29] [41], das mit einem zum Nageralbumin nicht-kreuzreaktiven Assay bestimmt oder auch direkt FITC-markiert werden kann [42]. Im Gegensatz zu den radionuklid-basierten Assays dürfte Hämoglobin bei photometrischen Bestimmungsmethoden interferieren. Da transmurale Schäden quasi obligatorisch mit alveolärer Hämorrhagie einhergehen, ist somit mit einem gewissen Grad von Interferenz bei den photometrischen Methoden zu rechnen.

BAL zur Ex-vivo-Stimulation und zur In-vivo-Stimulation

BAL-Überstände dürften das alveoläre Mediatormilieu einigermaßen abbilden. Neben der direkten Messung von Mediatoren können BAL-Überstände auch zur Stimulierung anderer Zellpräparationen eingesetzt werden, z. B. von Endothelzellen [43] [44] oder Neutrophilen [45]. Moxley u. Mitarb. [14] studierten gar die Übertragung eines LPS-Lungenschadens auf ein weiteres Tier durch die in der BALF beim LPS-Tier 5 h nach intratrachealer LPS-Injektion gewonnenen Zellen.

Die Zellmaterialgewinnung für Ex-vivo-Versuche als Alternative zu Zelllinien

Die BAL kann auch zur Materialgewinnung für Ex-vivo-Versuche durchgeführt werden. Dieser Ansatz ist für Untersuchungen an Alveolarmakrophagen derzeit ohne Alternative, da es bislang keine Alveolarmakrophagen-ähnliche Zelllinie gibt. Interessanterweise übersteigt die Fähigkeit der Alveolarmakrophagen zur Produktion von TNF die anderer Makrophagentypen bei weitem. Als Beispiel können bei der Ratte durch 5 × 10 ml Instillat etwa 1,5 × 10⁷ Alveolarmakrophagen mit einer Viabilität von 96 - 98 % aus der Lunge ausgewaschen, durch Adhärenz gewonnen und in Kultur genommen werden, im Vergleich zu ca. 3,5 × 10⁷ Peritonealmakrophagen aus derselben Ratte [46].

Danksagung

Die Arbeit von J. Hamacher wurde durch die „Deutsche Forschungsgemeinschaft” [FOR 321/2 - 1; Forschergruppe „Endogene Gewebszerstörung: Mechanismen der Autodestruktion”] und den Herrmann Josef Schieffer-Preis der „Freunde des Universitätsklinikums Homburg e. V.” unterstützt.

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