Ein mRNA-Chip zur Vereinfachung der genetischen Diagnostik

Fragestellung: Neuromuskuläre und neurodegenerative Erkrankungen sind häufig mit Veränderungen des oxidativen Stoffwechsels verbunden, z.B. verursacht durch Mutationen im mitochondrialen oder Kerngenom. Diese führen zu einer vom „Normalzustand“ differenten Genexpression. Ausgehend von dieser Hypothese haben wir einen mRNA-Chip entwickelt, um die Expression von 169 Genen des oxidativen Stoffwechsels simultan zu detektieren.

Ziel der Arbeit war, am Beispiel des MELAS-Syndroms (Mitochondriale Enzephalomyopathie, Laktatazidose, Schlaganfall-ähnliche Episoden) zu zeigen, dass die MELAS-Mutation (A3243G) zu einer Veränderung der Genexpression führt. Somit könnten charakteristische „genetische Fingerabdrücke“ für zugrunde liegenden Erkrankungen erstellt werden.

Methoden: Es wurden rund 300 Gene des oxidativen Stoffwechsels aus Datenbanken (PubMed, Mitomap) ausgewählt und für jedes Gen Primer designed. Anschließend wurde aus 3 humanen cDNA-Banken mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) aus jedem Gen 112 Basenpaare (bp) lange DNA-Sequenzen amplifiziert und in gleicher Menge auf eine Nylonmembran (Blot) aufgebracht. Die mRNA kultivierter B-Lymphozyten mit unterschiedlicher Heteroplasmie der MELAS-Mutation wurde isoliert, in cDNA umgeschrieben, radioaktiv markiert und mit dem Blot hybridisiert. Nach dem Waschen wurde das Ergebnis per Autoradiographie detektiert. Zum Vergleich zweier Blots wurden ihre belichteten Filme digitalisiert und mithilfe einer Software übereinandergelegt, nachdem ein Film invertiert worden war. Anschließend wurden die Helligkeitswerte korrespondierender Punkte auf dem Blot addiert, so dass sich gleiche Helligkeitswerte gegenseitig aufhoben und unterschiedliche Helligkeitswerte sich entweder dunkel oder hell darstellten.

Ergebnisse: Es zeigten sich deutliche Unterschiede im Expressionsprofil von B-Lymphozyten mit 80% Heteroplasmie der MELAS-Mutation im Gegensatz zu B-Lymphozyten ohne MELAS-Mutation. Abbildung 1 zeigt die Unterschiede im Expressionsprofil von normalen B-Lymphozyten und Lymphozyten mit der MELAS-Mutation.

Schlussfolgerungen: Die Detektion von Änderungen im Expressionsprofil aufgrund einer Mutation im mitochondrialen Genom ist mit dem mRNA-Chip möglich. Nun kann die Diagnostik von Störungen des oxidativen Stoffwechsels vereinfacht werden, in dem charakteristische „genetische Fingerabdrücke“ erstellt werden und die in der Diagnostik erhaltenen Expressionsprofile mit diesen verglichen werden.

Abb. 1: Vergleich des Expressionsprofils MEL AS-positiver und -negativer B-Lymphozyten.