Cryopreserved Semilunar Heart Valve Allografts: Leaflet Surface Damage in Scanning Electron Microscopy

Abstract

Objective: Allograft heart valves (AHV), biological valves of human origin, offer potential advantages over conventional xenografts in terms of superior hemodynamics and, perhaps, better durability. The most important factors for long-term AHV clinical performance are the processing and cryopreservation methods. The aim of this study was to evaluate the impact of current processing protocol on valve tissue morphology, mainly to address the effect of successive processing steps on the leaflet surface structure. For the detection of fine changes in endothelial covering and underlying layers, our own modification of the scanning electron microscopy (SEM) technique was utilized. Material and Methods: The study was based on an investigation of 20 AHV (40 specimens). Fourteen valves came from heart-beating donors (multiorgan harvesting) when the heart could not be transplanted for any reason (donor criteria, availability of recipient and / or logistics). Six were obtained at the time of routine postmortems – non heart-beating donors (NHBD). All specimens were initially fixed in Baker's solution. Tissue samples were dissected, dried with hexamethyldisilazane (HMDS), gold-coated, studied and photographed by SEM (Tesla BS 301). In order to define the integrity of the endothelium, subendothelial layers and the quality of the surface under SEM, a special six-level score system was introduced: 1 – intact endothelium, 2 – confluent endothelium with structural inhomogeneity, 3 – disruption of intercellular contacts, 4 – separation of endothelial cells, 5 – complete loss of endothelium, 6 – damage of subendothelial layers). AHV samples were divided into 4 groups for comparison. One aortic AHV “fresh” control sample obtained from a heart-beating donor was evaluated without any processing and was compared with (i) tissue from AHV obtained from NHBD with warm ischemia of 12 and 48 hours, (ii) samples stored at + 4 °C in saline for 24 h, (iii) antibiotic-treated tissue for 24 h at 37 °C and finally with (iv) cryopreserved valves stored in liquid nitrogen (– 196 °C) for 6–38 months. Results: Our alternative for drying samples by the HMDS method proved to be suitable for thin membranes of human semilunar valves. We were able to detect early changes in the endothelium after harvesting and denudation of the endothelial covering during preservation with and without freezing. The surface of the AHV samples revealed the typical features and score system determined endothelial cell damage. Control “fresh” sample: score 2, (i) NHBD samples with warm ischemia of 12 h: score 3–4, with warm ischemia of 48 h: score 4–5, (ii) samples stored at + 4 °C in saline for 48 h: score 5–6, (iii) antibiotic-treated tissue for 24 h at 37 °C: score 5, (iv) cryopreserved valves stored in liquid nitrogen for 6–38 months: score 5–6. Conclusion: SEM (using HMDS drying) together with other methods may be helpful for the morphological control of processing, cryopreservation and liquid nitrogen storage of AHV. Severe AHV leaflet endothelial destruction was proven on AHV grafts. These changes arose already in the initial steps of tissue processing, just after the donor heart harvesting and then at the time of antibiotic valve graft treatment. These results are considered as the starting point for the development of a better preservation protocol.

Zusammenfassung

Ziel: Herzklappen-Allograftpräparate (AHV), biologische menschliche Klappen, bieten Vorteile gegenüber konventionellen Xenograft-Präparaten in Bezug auf eine bessere Hämodynamik und möglicherweise auch bessere Haltbarkeit. Verarbeitung und Kryokonservierungs-Methoden stellen die wichtigsten Faktoren für eine Langzeit-Funktionsfähigkeit der AHV dar. Ziel dieser Studie war die Beurteilung des Einflusses der gegenwärtigen Bearbeitungs-Methoden auf die Gewebemorphologie der Klappenoberfläche. Um feinste Veränderungen der Endothelialschicht und darunter liegender Schichten aufzuspüren, verwendeten wir die von uns modifizierte Rasterelektronenmikroskopie-Technik (REM).Material und Methoden: Die Studie stützte sich auf die Untersuchung von 20 AHV (40 Präparate). Vierzehn Klappen stammten von Lebendspendern (Multiorganspenden), bei denen das Herz aus verschiedenen Gründen nicht transplantiert werden konnte (Spenderkriterien, Verfügbarkeit von Empfängern und / oder Logistik). Sechs wurden bei Routine-Autopsien entnommen – Nicht-Lebendspender (NHBD). Alle Präparate wurden anfänglich in Baker-Lösung fixiert. Gewebeproben wurden präpariert, mit Hexamethyldisilizan (HMDS) getrocknet, goldbeschichtet und mit REM (Tesla BS 301) untersucht und fotografiert. Um die Intaktheit von Endothel, subendothelialen Schichten und die Qualität der Oberfäche im REM zu bestimmen, wurde ein spezielles sechsstufiges Bewertungssystem eingeführt: 1 – intaktes Endothel, 2 – zusammenhängendes Endothel mit struktureller Inhomogenität, 3 – Unterbrechung des interzellulären Kontakts, 4 – Separation der Endothelzellen, 5 – vollständiger Verlust des Endothels, 6 – Beschädigung der subendothelialen Schichten. Die AHV-Proben wurden zum Vergleich in 4 Gruppen eingeteilt. Eine „frische” Allograft-Aortenklappe eines Lebendspenders diente als Kontrollpräparat und wurde ohne jegliche Bearbeitung untersucht und verglichen mit dem Gewebe von (i) AHV von NHBD mit warmer Ischämie von 12 und 48 Stunden Dauer, (ii) Proben, die 24 Stunden bei + 4 °C in Kochsalzlösung aufbewahrt wurden, (iii) Antibiotika-behandeltem Gewebe, 24 Stunden bei 37 °C und schließlich (iv) kryokonservierten Klappen, die 6–38 Monate in flüssigem Stickstoff (–196 °C) aufbewahrt wurden. Ergebnisse: Unsere Alternative, Präparate mit der HDMS-Methode zu trocknen, erwies sich als geeignet für dünne Membranen von menschlichen Semilunarklappen. Wir konnten frühe Veränderungen des Endothels nach Gewinnung und Entkernung der endothelialen Deckschicht erkennen, die während der Aufbewahrung mit und ohne Gefrieren entstanden waren. Die Oberfläche der AHV-Proben zeigte typische Veränderungen, und das Stufenschema ermöglichte eine Einordnung des Ausmaßes der Endothelschäden. Das „frische” Kontrollpräparat: Stufe 2; (i) NHBD-Proben mit warmer Ischämie von 12 Stunden Dauer; Stufe 3–4, warme Ischämie von 24 Stunden Dauer: Stufe 4–5; (ii) Proben, die bei +4 °C 24 Stunden in Kochsalzlösung aufbewahrt wurden: Stufe 5–6; (iii) 24 Stunden bei 37 °C mit Antibiotika behandeltes Gewebe: Stufe 5; (iv) kryokonservierte Klappen, 6–38 Monate in flüssigem Stickstoff aufbewahrt: Stufe 5–6. Schlussfolgerung: Die REM (mit HDMS-Trocknung) kann in Verbingung mit anderen Methoden hilfreich sein bei der morphologischen Überprüfung von Bearbeitung, Kryokonservierung und Aufbewahrung von AHV in flüssigem Stickstoff. Bei AHV-Transplantaten konnte eine schwere Endothelschädigung von AHV-Klappen nachgewiesen werden. Diese Beschädigungen entstanden bereits bei den ersten Schritten der Gewebeverarbeitung, unmittelbar nach der Gewebeentnahme beim Spender sowie später während des Zeitraums der antibiotischen Behandlung von Transplantaten. Wir sehen diese Ergebnisse als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines besseren Konservierungsprotokolls.

Key words

allograft heart valves - cryopreservation - scanning electron microscopy - tissue morphology

Schlüsselwörter

Allograft-Herzklappen - Kryokonservierung - Rasterelektronenmikroskopie - Gewebemorphologie

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