Züchtung menschlichen Knorpelgewebes in einer dreidimensionalen Perfusionskulturkammer: Charakterisierung der Kollagensynthese

Zusammenfassung

Der große Bedarf an vitalem Knorpeltransplantatmaterial in der rekonstruktiven Chirurgie des Kopf-Hals-Bereiches erfordert die Anwendung moderner Gewebekulturmethoden zur Züchtung von autologen Transplantaten. Ein kürzlich entwickeltes dreidimensionales Perfusionskultursystem stellte die Voraussetzungen zum Erhalt der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften von Chondrozyten in vitro bereit. Ziel der Studie war die Charakterisierung der Kollagensynthese von Chondrozyten unter diesen Bedingungen. Aus gesundem humanen Septumknorpel wurden Chondrozyten enzymatisch isoliert und in Monolayerkultur angezüchtet. Anschließend wurde eine 1%-Zell-Agarose-Suspension hergestellt, die nach ihrer Verfestigung mit einer 3% Agarosehülle umgeben wurde. Diese Kulturen wurden in das Perfusionskultursystem eingebracht und dort über 2 Wochen beobachtet. Es zeigte sich elektronenmikroskopisch die Bildung neuer Kollagenfibrillen. Die Fibrillen konnten immunohistochemisch als Kollagen Typ II identifiziert werden. Durch In-situ-Hybridisierung wurde keine mRNA für Kollagen Typ X nachgewiesen und damit die Entwicklung eines hypertrophischen Phänotyps der Chondrozyten ausgeschlossen. Die Zellen wiesen nur geringe Variationen in Form und Größe auf, die Zellkerne waren rund konfiguriert. Die vorliegenden Ergebnisse erlauben den Schluß, dass unter den angegebenen Kulturbedingungen eine knorpelähnliche Matrix entsteht.

Summary

In reconstructive head and neck surgery, there is a great need for cartilage transplants. Sufficient autologous graft is often not available. Heterologous cartilage is used frequently, although there is danger of transmitting viral infections and resorption rates are high. We have developed a three-dimensional model for the formation of cartilage in vitro. The aim of this study was to characterize the collagen synthesis under these culture conditions. Human chondrocytes were isolated by digesting septal cartilage matrix in the presence of type II collagenase, hyaluronidase, and Dnase II in Ham's F12 medium. The resulting cells were kept in monolayer culture for one week and then suspended in 2% ultra-low-melting agarose (1:1). The cell-agarose conglomerate was encapsulated with a 3% ultra-low-melting agarose solution and placed in a perfusion culture chamber. A permanent flow of fresh medium (Ham's F-12 supplemented with 50 µg/ml ascorbic acid and 2% fetal calf serum) was provided by a peristaltic pump which delivered 1 ml/h with on/off intervals of 30 min. Samples were recovered after two weeks. Using electron microscopy abundant collagen fibril formation was shown. The collagen fibrils were identified histologically as cartilage specific type II collagen. No mRNA expression of collagen type X was observed using in situ hybridization. The cells appeared in a round cell shape with round nucleus and only slight variations in form and size. The present results indicate that the chondrocytes maintain their differentiated phenotype and continue to synthesize typical matrix products in this three-dimensional perfusion culture chamber. The synthesis of cartilage as graft material in reconstructive surgery might to be possible with this new culture system.

Schlüsselwörter

Knorpeltransplantation - Chondrozyten - Dreidimensionale Zellkultur - Elektronenmikroskopie - Immunohistochemie - In-situ-Hybridisierung

Key words

Cartilage grafting - Chondrocytes - Three-dimensional cell culture - Histology - In-situ hybridization - Electron microscopy