Targeted Sterically Stabilized Immunoliposomes: Effect of Bilayer Composition and Temperature on the Antitumor Activity in vitro

Zusammenfassung

Liposome (100-120) von Dipalmitoylphosphatidycholin, hydriertem Soja-Phosphatidylcholin, Cholesterol und Poly-(Ethylenglykol) (PEG)-modifiziertem Phosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) bei einem molaren Verhältnis von (2:1:0,6:0,09) wurden gegen die extrazelluläre Domäne von HER2/ neu mit FAB-Fragmenten eines humanisierten rekombinanten monoklonalen Antikörpers konjugiert, um thermosensitive, sterisch stabilisierte Immunoliposome als Medikamententräger zu schaffen, die auf überexprimierende HER2-Krebszellen abzielen. Die Konjugation erfolgte durch eine neue Insertionstechnik, bei der der Antikörper zuerst mit PEG - DSPE konjugiert wurde und anschließend nach der Bildung zu den sich ergebenden Liposomen hinzugefügt wurde. Die Konjugation des Antikörpers mit den Liposomen beeinflusste nicht die Gesamtgröße der Liposome, wie durch die dynamische Lichtstreuungstechnik bestimmt wurde. Die Liposome wurden unter Verwendung der Ammoniumsulfat-Gradientenmethode mit Doxorubicin als antineoplastische Substanz geladen. Es stellte sich heraus, dass die sich ergebenden antikörper-konjugierten Vesikel in 50 % des menschlichen Plasmas, in 50 % des Rattenplasmas und in 10 % des Kalbsfötusserums stabil waren, indem sie eine minimale Freisetzung des Medikaments bei 37 °C und einem pH-Wert von 7,2 zeigten. Ein Absenken des pH- Wertes auf 5,5 beeinflusste die Freisetzung des Medikaments von den Liposomen nicht. Durch eine Erhöhung der Temperatur auf 42 °C wurde jedoch die Freisetzung des Medikaments in den verschiedenen biologischen Medien verursacht. Eine Änderung der Bilayer-Zusammensetzung, um nicht thermosensitive, sterisch stabilisierte Immunoliposome unter Verwendung von hydriertem Sojaphosphatidylcholin, Cholesterol und Poly- (Ethylenglykol) (PEG)-modifiziertem Phosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) bei einem molaren Verhältnis von (1,5:1:0,1) zu bilden und durch Anlagerung des mit Doxorubicin geladenen Antikörpers (anti-HER2) an die Liposome, verursachte eine minimale Freisetzung des Medikaments in den verschiedenen biologischen Medien bei 37 °C und 42 °C. Die Aufnahme von Anti-HER2-Immunoliposomen durch überexprimierende HER2-Zellen (SKBR-3-Zellen) stellte sich als achtfach so stark heraus wie bei den nicht zielgerichteten Liposomen, und zwar sowohl bei den thermosensitiven als auch nicht thermosensitiven Liposomen. Die Antitumor-Aktivität beider Arten von Liposomen wurde durch Messung der Zell-Zytotoxizität nach der Liposomeninkubation mit Zellen gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei 37 °C (sowohl zielgerichtete oder nicht zielgerichtete) thermosensitive Liposome beim Abtöten von Zellen effizienter waren als (sowohl zielgerichtete oder nicht zielgerichtete) nicht thermosensitive Liposome. Der berechnete IC₅₀ für die zielgerichteten thermosensitiven Liposome ähnelte stark dem berechneten IC₅₀ (0,6 µg/ml) für freies Doxorubicin. Außerdem ähnelte der zytotoxische Effekt von nicht zielgerichteten thermosensitiven, sterisch stabilsierten Liposomen ziemlich dem von zielgerichteten, nicht thermosensitiven, sterisch stabilisierten Liposomen (IC₅₀ für nicht zielgerichtete thermosensitive Liposome = 3 µg/ml, IC₅₀ für zielgerichtete, nicht thermosensitive Liposome = 2,5 µg/ml). Die Erwärmung der Zellen auf 42 °C für eine Stunde nach der Liposomeninkubation führte jedoch bei beiden Arten von Liposomen zu keiner Steigerung des zytotoxischen Effekts. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Liposomenzusammensetzung eine äußerst wichtige Rolle in der Abgabe von Medikamenten an bestimmte Tumorzellen spielt und diese Rolle ist möglicherweise genauso wichtig wie die zielgerichtete Einheit. Außerdem leistet die schnelle Freisetzung des Medikaments durch einen externen Faktor, wie z.B. die Temperatur, möglicherweise keinen direkten Beitrag zur Wirksamkeit der Liposome als Trägermedium für das zielgerichtete Medikament.

Summary

Liposomes (100-120) of Dipalmitoylphosphatidycholine, hydrogenated soy phosphatidylcholine, cholesterol, and poly-(ethylene glycol) (PEG)-modified phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) at a molar ratio of (2:1:0.6:0.09) were conjugated to Fab' fragments of a humanized recombinant monoclonal antibody against the extracellular domain of HER2/ neu to create thermosensitive sterically stabilized immunoliposomes as a drug carrier targeting HER2-overexpressing cancers. Conjugation was performed by a new insertion technique, in which the antibody was first conjugated to PEG-DSPE first, then added to the resultant liposomes after being formed. Conjugation of the antibody to the liposomes did not affect the overall size of the liposomes as determined by dynamic light scattering technique. The liposomes were loaded with doxorubicin as an anticancer drug using ammonium sulphate gradient method. The resultant antibody conjugated vesicles were found to be stable in 50 % human plasma, 50 % rat plasma and 10 % fetal calf serum by showing a minimal release of the drug at 37°C and pH = 7.2. Lowering the pH to 5.5 did not affect the release of the drug from the liposomes. However, raising the temperature to 42°C caused the release of the drug in the different biological mediums. Changing the bilayer composition to form a non thermosensitive sterically stabilized immunoliposomes by using hydrogenated soy phosphatidylcholine, cholesterol, and poly-(ethylene glycol) (PEG)-modified phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) at a molar ratio of (1.5:1:0.1) and attaching antibody (anti HER2) to the liposomes after loading it with doxorubicin caused minimal release of the drug in the different biological mediums at 37°C and 42°C. Uptake of anti-HER2 immunoliposomes by HER2-overexpressing cells (SKBR-3 cells) were found to be 8 times more than non targeted liposomes for both thermosensitive and nonthermosensitive. The antiturnor activity for both kinds of liposomes was evaluated by measuring the cell cytotoxicity after liposome incubation with cells. The results showed that thermosensitive liposomes (either targeted or non targeted) were more effective in terms of cell killing than nonthermosensitive liposomes (either targeted or non targeted) at 37°C. In fact, the calculated IC₅₀ for targeted thermosensitive liposomes was quite similar to the calculated IC₅₀ (0.6 µg/ml) for free doxorubicin. Moreover, the cytotoxic effect of non-targeted thermosensitive sterically stabilized liposomes was quite similar to targeted non-thermosensitive sterically stabilized liposomes (IC₅₀ for non-targeted thermosensitive = 3 µg/ml, IC₅₀ for targeted non-thermosensitive = 2.5 µg/ml). However, heating the cells to 42°C for one hour after liposome incubation did not enhance the cytotoxic effect for both kinds of liposomes. These results indicate that liposome composition plays a very important role in the delivery of drugs to certain tumor cells, and this role may be as important as the targeting moiety. Moreover, fast release of the drug by an external factor such as temperature may not have a direct contribution on the efficiency of the liposomes as a targeting drug delivery vehicle.

Schlüsselwörter

Liposome - Doxorubicin - Anti-HER2 - Brustkrebs - Temperatur - Zytotoxizität - Zellaufnahme - Fluoreszenz

Keywords

Liposomes - Doxorubicin - Anti-HER2 - coping - Breast Cancer - Temperature - Cytotoxicity - Cellular Uptake - fluorescence

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