Entwicklung und Evaluation eines neuartigen 3D-Blasenmatrixmodelles zur standardisierten Untersuchung verschiedener Transfektionsmethoden

Zusammenfassung

Fragestellung: Strategien für Gentherapien stellen einen viel versprechenden neuen Ansatz bei der Behandlung von Krebserkrankungen dar. Deshalb wird gegenwärtig intensiv nach neuen Möglichkeiten des Gentransfers gesucht. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind In-vitro-Versuche an Zellkulturen und In-vivo-Experimente an Tieren die verfügbaren Möglichkeiten, neue Gentransfermethoden zu untersuchen. Wir haben daher den Versuch unternommen, ein geeignetes 3D-Matrixmodell als alternative Möglichkeit zu zellkulturellen Arbeiten und Tierversuchen zu entwickeln und zu evaluieren. Dieses Modell soll dabei als Zwischenschritt und nicht als Ersatz für eine der beiden oben beschriebenen herkömmlichen Verfahren verstanden werden. Material und Methode: Auf der Basis einer Small-Intestinal-Submukosa(SIS)- oder Polyethylen(PET)-Membran auf einer Scheibe eines Agarose-Gels konstruierten wir ein neues dreidimensionales Blasenmodell. Dieses Modell, bestehend aus humanen glatten Muskelzellen und humanen Blasenkarzinomzellen, wurde durch eine Behandlung mit Lipofectamine™2000 und einem pEGFP-Plasmid exemplarisch transfiziert. Die erreichte Transfektion wurde durch Fluoreszenzmikroskopie nach der Anfertigung von Kryoschnitten abgebildet. Ergebnisse: Mit Hilfe der oben beschriebenen Methode war es möglich, adhärentes dreidimensionales Gewebe aus humanen glatten Muskelzellen und humanen Blasentumorzellen sowohl auf der SIS- als auch auf der PET-Membran zu kultivieren und mit Plasmid-DNA zu transfizieren. Schlussfolgerung: Mit dieser Arbeit konnte ein neues dreidimensionales Blasenmatrixmodell etabliert werden, welches die standardisierte Untersuchung neuer Transfektionsmethoden ex vivo ermöglicht. Mit Hilfe dieses 3D-Modells ist es möglich, mehrschichtige Gewebe bestehend aus unterschiedlichen Zelllinien reproduzierbar und standardisiert zu kultivieren.

Abstract

Purpose: Gene therapy strategies are a promising new alternative option in the treatment of cancer diseases and great effort is dedicated to the development of new gene transfer methods. At present, in vitro cell culture experiments or in vivo animal trials are the only available alternatives in the search for new gene transfer methods. We attempted to develop and evaluate a new 3D matrix model as a step between in vitro experiments and animal trials. Materials and Methods: We generated a convenient model with an agarose gel as a basis for small intestinal submucosa or a polyethylene membrane. The produced model consisting of human smooth muscle cells and human bladder carcinoma cells was transfected with a modified standard Lipofectamine™2000 transfection procedure and visualised by fluorescence microscopy after cryo-sectioning. Results: With the help of this new technique it is possible to generate three dimensional tissues consisting of different types of cells in which the cells are adherent on the polyethylene and the SIS-membrane during the entire treatment. The resulting model was successfully transfected with the pEGFP-N1 plasmid. Conclusions: This new three dimensional model allows the standardised evaluation of new transfection methods on multilayered ex-vivo generated tissues consisting of different cells.

Schlüsselwörter

Transfektion - Blasenkarzinom - Tissue engineering

Key words

Transfection - tissue engineering - bladder neoplasms - gene therapy

Literatur

• 1 Garton K J, Ferri N, Raines E W. Efficient expression of exogenous genes in primary vascular cells using IRES-based retroviral vectors.  Biotechniques. 2002;  32 (4) 830
• 2 Karara A L, Bumaschny V F, Fiszman G L, Casais C C, Glikin G C, Finocchiaro L M. Lipofection of early passages of cell cultures derived from murine adenocarcinomas: in vitro and ex vivo testing of the thymidine kinase/ganciclovir system.  Cancer Gene Ther. 2002;  9 (1) 96
• 3 Kaneda Y. Improvements in gene therapy technologies.  Mol Urol. 2001;  5 (2) 85
• 4 Nomura T, Nkajima S, Kawabata K, Yamashita F, Takakura Y, Hashida M. Intratumoral pharmakokinetics and in vivo gene expression of naked plasmid DNA and its cationic liposome complexes after direct gene transfer.  Cancer Res. 1997;  57 2681
• 5 Sato M, Ishikawa A, Kimura M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa.  Mol Reprod Dev. 2002;  61 (1) 49
• 6 Sutherland R S, Baskin S B, Hayward S W, Cunha G R. Regeneration of bladder urothelium, smooth muscle, blood vessels and nerves into an acellular tissue matrix.  J Urol. 1996;  156 571
• 7 Sugasi S, Lesbros Y, Bisson I, Zhang Y Y, Kucera P, Frey P. In vitro engineering of human stratified urothelium: analysis of its morphology and function.  J Urol. 2000;  164 951
• 8 Hutton K AR, Trejdosiewicz L K, Thomas D FM, Southgate J. Urothelial tissue culture for bladder reconstruction: an experimental study.  J Urol. 1993;  150 721
• 9 Cilento B G, Freeman M R, Schneck F X, Retik A B, Atala A. Phenotypic and catogenetic characterization of human bladder urothelia expanded in vitro.  J Urol. 1994;  152 665
• 10 Petzoldt J L, Leigh I M, Duffy P G, Masters J RW. Culture and characterisation of human urothelium in vivo and in vitro.  Urol Res. 1994;  22 67
• 11 Baskin L S, Howard P S, Duckett J W, Snyder H M, Macarak E J. Bladder smooth muscle cells in culture: I. Identification and characterization.  J Urol. 1993;  149 190
• 12 Kim B-S, Baez C, Atala A. Biomaterials for tissue engineering.  World J Urol. 2000;  18 2
• 13 Hench L L, Polak J M. Third-generation biomedical materials.  Science. 2002;  295 (5557) 1014
• 14 Oberpenning F, Meng J, Yoo J J, Atala A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering.  Nat Biotechnol. 2000;  17 (2) 149
• 15 Atala A. Tissue engineering for bladder substitution.  World J Urol. 2000;  18 364
• 16 Falke G, Caffaratti J, Atala A. Tissue engineering of the bladder.  World J Urol. 2000;  18 36