Entwicklung einer HPLC-Methode zur Diagnostik der heparin-induzierten Thrombozytopenie

In der Diagnostik der Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) gilt der C14-serotonin release assay (SRA) aus Spenderthrombozyten als sensitivster und spezifischster Test mit dem Nachteil der Verwendung von radioaktivem Material. Andere nicht-radioaktive Methoden weisen eine geringere Sensitivität oder Spezifität auf. Der nicht-radioaktive Enzym-Immunoassay (EIA-SRA) zeigt eine mit dem C14-SRA vergleichbare Sensitivität und Spezifität, hat jedoch den Nachteil einer sehr zeitaufwendigen Durchführung. Ein neues Nachweisverfahren für die Freisetzung von Serotonin aus gesunden Spenderthrombozyten in Gegenwart von Heparin-induzierten Antikörpern und Heparinen wurde mittels einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-Methode entwickelt. Für dieses Verfahren werden keine radioaktiven Materialien benötigt und die Ergebnisse stehen schon nach 1,5 Stunden zur Verfügung. Die Spezifität und Sensitivität wurde an mehreren Patientengruppen geprüft. Insgesamt wurden 99 Proben von normalen Kontrollen (n = 60), HIT-Patienten (n = 19) und non-HIT-Patienten (n = 20) untersucht. Die Patientenseren wurden mit Spenderthrombozyten und 0,02 IU/ml bzw. 10 IU/ml unfraktioniertem Heparin (UFH), niedermolekularem Heparin (LMWH) und 0,02 bzw. 1 IU/ml Danaparoid inkubiert. Die freigesetzte Serotoninmenge wurde mittels der neuen HPLC-SRA-Technik quantitativ aus 300 000 Plättchen/µl bestimmt. Für die HPLC-Methode wurde eine Nukleosil-C18-Säule mit entsprechender Vorsäule, ein elektrochemischer Detektor und L-Dopa-Laufmittel verwendet, das auf einen pH-Wert von 2,3 eingestellt wurde. Die Konzentration wurde mithilfe einer Serotonin-Standardkurve ermittelt. Serotonin wurde als Einzelpeak nach 16,2 - 16,9 Minuten eluiert. Die Seren von HIT-Patienten setzten in Anwesenheit von 0,2 IU/ml UFH 5,56 - 352,55 ng/ml Serotonin frei, nach Inkubation mit 0,2 IU/ml LMWH und Spenderthrombozyten wurde 6,67 - 1533,33 ng/ml Serotonin ausgeschüttet. Ein Maximum von 2,42 ng/ml Serotonin konnte nach Inkubation mit 0 IU/ml UFH oder LMWH gemessen werden. Bei einer Konzentration von 10 IU/ml UFH oder LMWH lag die höchste Serotoninkonzentration bei 20 ng/ml. Von 19 Proben, die im EIA-SRA positiv waren, erhielten wir ein positives Ergebnis nach Inkubation mit 0,2 IU/ml Heparin, eine Probe war auch bei 10IU/ml Heparin noch positiv. Es gab keine Freisetzung von Serotonin in Anwesenheit von Danaparoid. Alle 60 gesunden Probanden und alle 20 Non-HIT-Patienten wurden als negativ erkannt, wie es sich auch im EIA-SRA bestätigen ließ. Verglichen mit dem EIA-SRA betrug die Sensitivität des HPLC-SRA 94,7 Prozent und die Spezifität 100 Prozent. Die HPLC-SRA weist als Vorteil den fehlenden Gebrauch von radioaktiven Substanzen sowie die Möglichkeit zur Quantifizierung des Serotonins aus den Dense-Granula der Thrombozyten auf. Des weiteren zeichnet sich diese Methode durch ihre einfache und zeitsparende Durchführbarkeit aus, bei der die Ergebnisse schon nach 1,5 Stunden zur Verfügung stehen. Diese sensitive und spezifische Methode stellt ein alternatives Verfahren in der Diagnostik der Heparin-induzierten Thrombozytopenie dar.