Entwicklung eines transplantierbaren Hautäquivalentes auf Basis von Matriderm^® mit menschlichen Keratinozyten und Fibroblasten

Zusammenfassung

Es wurde eine zellbasierte Wundauflage mit Keratinozyten und Fibroblasten auf Basis einer kommerziellen Wundauflage (Matriderm^®, Kollagen/Elastin-Matrix) generiert, um damit großflächige Verbrennungswunden behandeln zu können. Zunächst wurde die Expansion der Keratinozyten optimiert und die Zeit für die Anzüchtung minimiert. Ausgangsmaterial waren 1–2 cm² Spalthaut vom Patienten. Epidermis und Dermis wurden nach einer enzymatischen Behandlung mit Thermolysin voneinander getrennt. Aus den beiden Hautkompartimenten wurden durch Trypsin- und Kollagenase I-Behandlung Keratinozyten und Fibroblasten isoliert, welche in Kollagen I-beschichteten Zellkulturflaschen expandiert wurden. Nach 10 Tagen wurden die Fibroblasten auf 100 cm² Matriderm aufgebracht. Nach einwöchiger submerser Kultivierung wurden die Keratinozyten ausgesät. Eine Woche später wurde die Matrix an die Luft-Flüssigkeitsgrenze angehoben, um die epidermale Differenzierung einzuleiten. Nach 16 Tagen an der Luft-Flüssigkeitsgrenze wurde das Hautäquivalent fixiert und immunhistologisch sowie elektronenmikroskopisch begutachtet. Die Histologie zeigte eine regelgerechte Stratifizierung des epidermalen Anteils. Immunhistologisch ließ sich eine Basalmembran mit Kollagen IV nachweisen. Desmoglein, sowie die Differenzierungsmarker Involucrin und Zytokeratin 10 wurden suprabasal nachgewiesen. Elektronenmikroskopisch waren die Basalmembran sowie die Zell-Zell-Verbindungen in Form von Desmosmen zu erkennen. Späte Differenzierungsmerkmale, wie granuläre Strukturen und verdickte Zellmembranen, fanden sich im stratum granulosum und stratum corneum. Die Studie zeigt, dass man aus Matriderm eine zellbasierte Wundauflage herstellen kann, die verglichen mit der entnommenen Spalthaut um den Faktor 50–100 vergrößert ist und deren Aufbau normaler Haut weitgehend entspricht. Dieses Hautäquivalent könnte klinisch geeignet sein, um tiefe Brandwunden zu behandeln.

Abstract

A cell-based wound coverage with keratinocytes and fibroblasts on the basis of a commercially available dermal substitute (Matriderm^®, Kollagen/Elastin matrix) was generated, in order to treat wide burn wounds. First the expansion of keratinocytes was optimised and the culturing time was minimised. Raw material was 1–2 cm² split skin. Dermis and epidermis were separated by enzymatic treatment with thermolysin. After treatment of both compartments with trypsin and collagenase I, keratinocytes and fibroblasts were isolated and expanded in collagen I coated dishes. After 10 days fibroblasts were seeded on Matriderm^®. After cultivation of the fibroblasts-containing matrix for one week keratinocytes were seeded on top. After an additional week of submersed cultivation the matrix was lifted up to the air-liquid interface to initiate epidermal cell differentiation. After 16 days in the air-liquid interphase the matrix was fixed and underwent immunohistochemical and electron microscopic analysis. Histological analysis showed a regularly stratification of the epidermal part. We observed collagen IV, a marker for the basement membrane, between epidermis and dermis. Desmoglein and the differentiation markers involucrine and cytokeratin 10 were found in the suprabasal layers of the epidermis. Electron microscopic analysis showed the basement membrane in the epidermal junction zone as well as cell-cell connections in the form of desmosomes. Late differentiation characteristics, like granular structures and the cornified layer, were found in the stratum granulosum and stratum corneum. Our results demonstrate that a skin equivalent can be generated by using a collagen/elastin matrix, with an expansion rate of 50–100-fold. This skin equivalent may be useful for covering deep wounds.

Schlüsselwörter

experimentelle Chirurgie - Haut-Äquivalent - Keratinozyten - Fibroblasten - Matriderm

Key words

tissue engineering - skin equivalnt - keratinocytes - fibroblasts - matriderm

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