Schneller und zuverlässiger Nachweis multiresistenter Staphylococcus aureus (MRSA) durch Multiplex-PCR

Zusammenfassung

Grundproblematik und Fragestellung: Staphylokokken gehören zu den häufigsten und gefährlichsten Erregern krankenhauserworbener Infektionen. In vielen Kliniken stellen vor allem Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) ein zunehmendes Problem dar, da sie »multiresistent« gegenüber sämtlichen Betalaktam-Antibiotika sind. Die einzige Therapiemöglichkeit sind oft Glykopeptide wie Vancomycin oder Teicoplanin. Bei Auftreten von MRSA müssen aufwendige und teure Isolierungsund Hygienemaßnahmen eingehalten werden. Um eine Ausbreitung solcher Erreger auf den Stationen effizient zu unterbinden, ist es notwendig, sie schnell und zuverlässig zu erkennen, wozu eine enge Kooperation zwischen Klinikern und Mikrobiologen erforderlich ist. Das Ziel unserer Untersuchungen war daher, durch den mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geführten Nachweis spezifischer Gen-Abschnitte MRSA sicher und schnell zu identifizieren und so zu einer effizienten Therapie und Erreger-Eliminierung beizutragen.

Methodik: 153 Staphylokokken-Stämme von hospitalisierten Patienten des Klinikums der Justus-Liebig-Universität Gießen wurden untersucht. Zur Differenzierung zwischen Staphylococcus aureus (S. aureus) und koagulasenegativen Staphylokokken (KNS) wurde das femB-Gen gewählt, das zur Spezies-spezifischen Identifizierung Methicillin-resistenter (MRSA) und -sensitiver S. aureus (MSSA) herangezogen werden kann. MRSA besitzen zusätzlich das für die Methicillin-Resistenz verantwortliche mecA-Gen, das den MSSA-Stämmen üblicherweise fehlt.

Ergebnisse: Mittels einer Multiplex-PCR, in der die Gene femB und mecA mit spezifischen Oligonukleotiden amplifiziert wurden, konnten MRSA-Stämme innerhalb von 3 Stunden eindeutig identifiziert werden. Das femB-Gen konnte in allen 102 getesteten S. aureus-Stämmen, aber in keinem der 51 KNS-Stämme gefunden werden. Das mecA-Gen wurde in 12 S. aureus-Stämmen gefunden, von denen phänotypisch elf als MRSA und einer als MSSA eingestuft wurden. Die Multiresistenz dieses als mecA-positiv/Methicillin-sensitiv identifizierten Stammes (kryptischer MRSA) konnte durch die Gabe von Flucloxacillin induziert werden.

Folgerungen: Die von uns vorgestellte Nachweismethode ist spezifisch für S. aureus und entdeckt sowohl phänotypische als auch kryptische MRSA. Diese kryptischen Stämme sind von besonderer klinischer Relevanz, da sie durch die herkömmlichen phänotypischen Nachweismethoden nicht erkannt werden. Es besteht die Gefahr, dass ihre Methicillin-Resistenz durch die Standardtherapie mit Flucloxacillin induziert wird und dass sie ihr genetisches Resistenzpotential unerkannt weitergeben können. Durch ihre sichere Identifizierung mittels PCR kann ein Therapieversagen von Flucloxacillin bei solchen Stämmen vermieden werden.

Abstract

Background and objective: Staphylococci are widespread pathogens and are frequently associated with nosocomial infections. Many hospitals struggle with increasing amounts of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) which are »multiresistant« against all betalactam antibiotics. Often, applicable antibiotics for treatment are only glycopeptides like vancomycin and teicoplanin. In addition, MRSA infected patients require expensive intensive isolation measures and strict hygiene. To efficiently prevent dissemination of these pathogens rapid and reliable identification and a close collaboration between clinicians and microbiologists are required. The purpose of our study was to set up a rapid and reliable identification procedure for MRSA by the amplification of specific gene determinants by PCR in order to to efficiently support therapy and eradication of the pathogen.

Methods: 153 strains of staphylococci isolated from in-patients of the hospital of the Justus-Liebig University of Gießen were examined. The femB gene was used to differentiate between Staphylococcus aureus (S. aureus) and coagulase-negative staphylococci (CNS), a gene which allows the species-specific identification of methicillin-resistant (MRSA) and -susceptible S. aureus (MSSA). Additionally, MRSA harbor the mecA gene encoding methicillin-resistance, which is absent in MSSA strains.

Results: Using a multiplex PCR with femB and mecA gene-specific oligonucleotides MRSA strains were unequivocally detected within 3 hours. The femB gene was detected in all 102 strains of S. aureus but in none of the 51 CNS. The mecA determinant was detected in 12 S. aureus. Among these, 11 strains were phenotypically methicillin-resistant and one strain was susceptible. The methicillin-resistance of this particular mecA-positive/methicillin-susceptible strain (cryptic MRSA) was inducible by cultivation on agar plates supplemented with flucloxacillin.

Conclusions: The described method specifically detects S. aureus and identifies phenotypical and cryptic MRSA. These cryptic MRSA are of particular relevance since they are undetectable using common phenotypically based detection methods. It is conceivable that the methicillin resistance of these strains is induced under antibiotic therapy with flucloxacillin and that the mec-encoded feature of methicillin-resistance can be transferred to previously methicillin-susceptible strains. Using the reliable detection of these strains by PCR, failure of flucloxacillin therapy is avoidable.