Für die In-vitro-Untersuchung der Inhibition von Cytochrom P450 (CYP)-Enzymen existieren
verschiedene Methoden, die sich vor allem in der Detektion der entstehenden Produkte
(Metabolite) unterscheiden. Bei allen Methoden werden Arzneistoffe oder artifizielle
Substrate mit dem Cosubstrat NADPH und humanen Lebermikrosomen oder rekombinanten
CYP-Enzymen sowie dem Inhibitor in einem geeigneten Puffer inkubiert und das Ausmaß
der Inhibition durch Quantifizierung der entstandenen Produkte kalkuliert.
Die Detektion der Metabolite kann bei Substraten, welche durch die Metabolisierung
in (stärker) fluoreszierende Produkte überführt werden, durch Messung der Fluoreszenzintensität
bei bestimmten Anregungs- und Emissionswellenlängen erfolgen. Im Gegensatz zu den
Mikrotiterplatten-basierten fluorimetrischen Verfahren erfolgt die Detektion bei HPLC-
oder LC/MS-Methoden getrennt von den jeweiligen Pflanzenextrakten (Inhibitoren). Da
bei den fluorimetrischen Verfahren die Detektion in Anwesenheit des Inhibitors (Pflanzenextrakts)
erfolgt, können durch „Quenching“ oder „Intrinsic Fluorescence“ (Eigenfluoreszenz)
falsch positive bzw. falsch negative Ergebnisse resultieren.
Um die Validität der fluorimetrischen Methoden für Pflanzenextrakte zu überprüfen,
wurde die Inhibition der CYP-Enzyme CYP1A2/2B6/2C8/9/19/2D6 und 3A4 durch neun Pflanzenextrakte
mit einem unterschiedlichen Inhaltsstoffspektrum mit der fluorimetrischen Gentest-Methode
und einem bereits etablierten LC/LCMS Assay untersucht. Zusätzlich hierzu wurden die
Eigenfluoreszenz und das „Quenching“ der Pflanzenextrakte bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen
(Umsatzraten) bestimmt.
Bei allen Pflanzenextrakten wurden durch Quenching und/oder Eigenfluoreszenz falsch
positive bzw. falsch negative Ergebnisse erhalten, wobei die Beeinflussung der Fluoreszenzintensität
vor allem von den verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen, aber auch von
der Umsatzrate (Metabolitenkonzentration) abhängt.
