Identifizierung und Charakterisierung einer protektiven Trypsin-Mutante

Einleitung: Die chronische Pankreatitis (CP) ist eine kontinuierliche oder rekurrierende entzündliche Erkrankung des Pankreas. Mutationen im kationischen Trypsinogen (PRSS1) und im Serinprotease-Inhibitor, Kazal Typ 1 (SPINK1) sind bei Pankreatitis beschrieben worden. Die Erkrankung kann somit Folge einer erhöhten proteolytischen Aktivität oder einer verminderten Proteaseninhibition sein, die zu einem Ungleichgewicht von Proteasen und deren Inhibitoren innerhalb des Pankreas führt. Demzufolge müssten Mutationen, die die Trypsinaktivität erniedrigen, protektiv wirken. Patienten/Methoden: Wir untersuchten DNA-Proben von 200 CP-Patienten sowie von 240 Kontrollen auf Mutationen im anionischen Trypsinogen (PRSS2). Die kodierenden Bereiche wurden mittels SSCP (single strand conformation polymorphism) sowie zusätzlich bei 50 ausgewählten Patienten und 50 Kontrollen mittels direkter Fluoreszenz-sequenzierung untersucht. Zudem erfolgte eine Schmelzkurven-Analyse von 1503 deutschen Patienten und 2016 deutschen Kontrollpersonen mittels FRET-Proben. Des weiteren untersuchten wir 804 Patienten und 4106 Kontrollen aus Dänemark, Frankreich, Holland, Indien, Italien, Österreich, Rumänien, Schweiz, Spanien und Tschechien mittels FRET-Proben. Die biochemische Charakterisierung (Aktivierung und Degradierung) erfolgte nach rekombinanter Expression der Mutante und des Wildtyps mittels Enzym-Aktivitätsmessungen, Gel-Elektrophorese und MALDI-TOF-MS. Ergebnisse: Wir fanden bei 71 von 2016 (3,5%) der deutschen Kontrollen eine Missense-Mutation, G191R, im Trypsinogen-Gen, die nur bei 20/1503 (1,3%) der Patienten mit CP detektiert werden konnte (p<0,001). G191R ließ sich ebenso bei den nicht deutschen Kontrollen in Vergleich zu den nicht deutschen Patienten in höherer Frequenz nachweisen (129/4106, 3,1% vs. 11/804, 1,4%; p<0,001). Die biochemischen Untersuchungen zeigten, dass durch G191R eine neue Trypsin-Schnittstelle entsteht, die das mutante Protein überempfindlich für autokatalytische Spaltung und schnelle Degradierung werden lässt. Zusammenfassung: Die neu identifizierte Trypsin-Mutation verringert die intrapankreatische Trypsinaktivität und schützt damit vor der Entstehung einer Pankreatitis.

Keywords: Genetik, PRSS2, Pankreatitis, Trypsin