Qualität verschiedener Bildanalyse-Systeme für die Auswertung von ELISPOT Platten

Die ELISPOT (Enzyme Linked Immuno Spot) Technik ist eine hochsensible Methode zum Nachweis von spezifischen Immunantworten auf Einzelzellebene. Zur Optimierung dieser Methode wurden verschiedene automatisierte Elispot Auswertungssysteme entwickelt. Bislang ist nicht bekannt, ob diese unterschiedlichen Systeme vergleichbare Ergebnisse liefern. Wir untersuchten deshalb 2 verschiedene Bildanalyse-Systeme, KS Elispot und KS Elispot compact (Zeiss Vision, Jena). Bei dem KS Elispot werden die Spots mit 12 Bildern/well (R12) über ein Auflichtmikroskop von einer Bildkamera aufgenommen (2,5µm pro Pixel). Der KS Elispot compact misst die Spots über eine Bildkamera an einem Stereomikroskop wahlweise mit 1 Bild/well (R1) oder mit 4 Bildern/well (R4). Bei beiden Systemen werden die Bilder mit 24 Bit Farbauflösung digitalisiert und mittels KS Elispot-Software ausgewertet. Wir untersuchten rot-braun gefärbte humane und Maus-Spots von gIFN-ELISPOT-Mikrotiterplatten. Die Statistik erfolgte nach Bland Altman-Plots. Die Anzahl der Spots pro well betrug 0–600 bei den humanen und 0–200 bei den Maus-Spots mit einem Spot-Durchmesser von 20–300µm (75% der Spots mit 20–50µm). R12 brauchte für eine komplette 96-well-Mikrotiterplatte 33 Min., R1 5 Min. und R4 14 Min. 0% der Spots wurden von R12, 6% von R1 und 4% von R4 als falsch positiv erkannt. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse war bei allen Systemgeräten sehr hoch (97–98%). Die unterschiedlichen Messergebnisse wurden als Mittelwerte x der Differenz von R12, R1, und R4 in absoluter Anzahl der Spots (und relativ in %) ermittelt. Humane Spots: x (R12-R1) 17 (26%) and x (R12-R4) 11 (20%). Mouse spots: x (R12-R1) 4 (-4%); x (R12-R4) 2 (10,2%). In unseren Untersuchungen benötigte KS Elispot compact (1 oder 4 Bildaufnahmen/well) für die Auswertung einer Platte höchstens 1/3 der Messzeit wie KS Elispot (12 Bildaufnahmen/well). KS Elispot identifiziert die Spots zuverlässiger als KS Elispot compact. Die größten Unterschiede stellten wir fest, wenn die Anzahl der humanen Spots/well über 400 und der Maus-Spots über 100 betrug. Für eine zuverlässige Auswertung von kleinen Spots (20–50µm) sollten mindestens 4 Bildaufnahmen/well gewählt werden.