Mikro- und Makrodeletionen chromosomaler Sequenzen führen zum Verlust der HLA Klasse I Expression auf Tumorzellen

Spezifische zytotoxische T Zellen haben die Fähigkeit, Tumorzellen gezielt zu zerstören. Derzeit wird in zahlreichen klinischen Studien das Potential verschiedener Immuntherapien evaluiert, diese T Zellen gegen den Tumor zu mobilisieren. Andererseits haben Tumorzellen „Escape-Mechanismen“ entwickelt, die es Ihnen ermöglichen, sich einer Erkennung durch spezifische T Zellen zu entziehen. Die molekularen Ursachen dieser „Escape-Mechanismen“ gilt es genau zu definieren, um zu verstehen, welche Verteidigungsstrategien ein Tumor nutzt und wie diese immuntherapeutisch zu umgehen sind. Daher verfolgte das vorliegende Projekt das Ziel, die molekularen Ursachen für den Verlust der HLA Klasse I Präsentation auf den Melanomzellinien Mel 249, Mel 499, Mel 505 und Mel 592 aufzuklären. Auf keiner der Tumorzellinien konnte die HLA Klasse I Oberflächenpräsentation durch Interferon-γ Behandlung wiederhergestellt werden. Dies legte die Vermutung nahe, dass eine Mutation im Beta2-Mikroglobulin Gen ursächlich für den HLA Klasse I negativen Phenotyp der Tumorzellen sein könnte. Tatsächlich konnte nach transienter Transfektion mit einem Beta2-Mikroglobulin (b2m) Expressionsplasmid eine Reexpression der HLA Klasse I Moleküle im Falle der Zellinien Mel 505 und Mel 592 eindeutig detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigte eine b2m Transfektion keinen Einfluss auf die HLA Klasse I Expression durch Mel 249 und Mel 499 Zellen, was wahrscheinlich auf die schlechte Transfizierbarkeit der Zellen zurückzuführen war. Um die Defekte genauer zu charakterisieren wurde Gesamt-RNA aus allen Zellinien sowie aus der positiven Kontrollzellinie Hela isoliert und diese anschließend in einer b2m-spezifischen RT-PCR eingesetzt. Entsprechend der Kontrolle konnte ein b2m-spezifisches cDNA Fragment im Falle von Mel 249 und Mel 499 Zellen detektiert werden. Durch Sequenzanalyse der PCR Produkte konnte eine 2 Basenpaardeletion in Exon II des b2m Gens für Mel 249 sowie eine Insertion von Intronsequenzen unterschiedlicher Länge zwischen Exon I und Exon II für Mel 499 detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte kein b2m-spezifisches cDNA Produkt für Mel 505 und Mel 592 erhalten werden. Daher sollten nachfolgend genomische b2m DNA Sequenzen von Mel 505 und Mel 592 unter Verwendung verschiedener Primerpaare amplifiziert werden. Im Gegensatz zur Kontrolle konnten keine b2m-genomischen DNA Sequenzen von Mel 505 und Mel 592 erhalten werden, was auf eine ausgedehnte Deletion genomischer Sequenzen hindeutete. Dies konnte durch „Loss of heterozygosity (LOH)” Analysen unter Verwendung verschiedener polymorpher Mikrosatelliten Marker, die stromaufwärts und stromabwärts des b2m Gens auf dem langen Arm (q) des Chromosom 15 lokalisiert sind, bestätigt werden.