Modulation of Na/K-ATPase activity by isoproterenol and propranolol in human non-pigmented ciliary epithelial cells[1]

Isoproterenol stimuliert die Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität in humanen nicht-pigmentierten Ziliarkörperepithelzellen

Hintergrund Nicht-pigmentierte Ziliarkörperepithelzellen nehmen eine Schlüsselfunktion in der Kammerwasserproduktion ein. Diese Zellen exprimieren verstärkt Natrium-Kalium-ATPase (Na⁺-K⁺-ATPase), welche aktiv Kalium in die Zellen transportiert. Die Funktion der Na⁺-K⁺-ATPase ist wichtig im Zusammenhang mit der Kammerwasserproduktion und wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Ziel dieser Studie war es, zu bestimmen, ob Isoproterenol, ein β-adrenerger Agonist, einer dieser Faktoren ist, welche die Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität in kultivierten humanen nicht-pigmentierten Ziliarkörperepithelzellen regulieren.

Methoden Die Bestimmung der Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität wird durch die Aufnahme von Rubidium (Rb⁺) in die Zellen gemessen. Humane nicht-pigmentierte Ziliarkörperepithelzellen (ODM2) wurden bis zur Konfluenz kultiviert. Vor dem Experiment wurde das Medium gewechselt. Die Zellen wurden in Ab- und Anwesenheit von Isoproterenol (0,01 - 10 μM) in Medium, welches Rb⁺ (3 mM) enthielt, für 30 Minuten inkubiert. Rb⁺ wurde aus den Zellen extrahiert und mittels Flammen-Emissionsspektrophotometrie bei 780 nm bestimmt. Das intrazelluläre Protein wurde mittels der Brodfad-Methode bestimmt. Die Ouabain-sensitive Rb⁺-Aufnahme entspricht der Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität. Dies wird errechnet durch den absoluten Rb⁺-Gehalt minus den Rb⁺-Gehalt, welcher durch Ouabain (3 mM) nicht inhibiert wird. Die Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität wird in Rb⁺ pM/mg Protein/min oder in Prozent der Kontrollwerte angegeben.

Ergebnisse Isoproterenol induziert eine dosisabhängige Aktivierung der Na⁺-K⁺-ATPase. Isoproterenol (1 μM) erhöhte die Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität fast 3fach gegenüber den Kontrollwerten (283 ± 58 %, p < 0,001). Propranolol, ein nicht selektiver β-Blocker, reduzierte die Na⁺-K⁺-ATPase-Aktivität signifikant in einer Konzentration von 0,01 bis 1 μM (maximale Hemmung bei 1 μM, 141 ± 42 vs. 659 ± 39 pM/mg Protein/min, p < 0,01).

Schlussfolgerungen Isoproterenol aktiviert die Na⁺-K⁺-ATPase in kultivierten nicht-pigmentierten Ziliarkörperepithelzellen. Dieser Effekt wird durch β-adrenerge Rezeptoren vermittelt.

Abstract

Purpose The present study investigates whether β-adrenoreceptor agents such as isoproterenol and propranolol can regulate Na⁺-K⁺-ATPase activity in cultured human non-pigmented ciliary epithelial cells.

Methods Human non-pigmented ciliary epithelial cells (ODM2) were grown to confluence. The active ion transport mediated by the Na⁺-K⁺-ATPase was evaluated by measuring ouabain-sensitive rubidium (Rb⁺) uptake. In a first set of experiments, cells were exposed to the β-adrenoreceptor agonist isoproterenol (0.01 - 10 μM). In a second set of experiments, cells were exposed to isoproterenol (1 μM) in the presence of different concentrations of the β-adrenoreceptor antagonist propranolol (0.01, 0.1, 1 μM).

Results In a concentration-dependent manner, isoproterenol induced an increase in Na⁺-K⁺-ATPase activity. The maximal Na⁺-K⁺-ATPase activity was observed at a concentration of 1 μM of isoproterenol (283 ± 58 %, P < 0.001). The increase in Na⁺-K⁺-ATPase activity evoked by isoproterenol (1 μM) was inhibited, in a concentration dependent manner, by propranolol (maximum: 659 ± 39 vs. 141 ± 42 pM/mg protein/min, P < 0.01).

Conclusion The β-adrenoreceptor agents isoproterenol and propranolol are apparently able to modulate Na⁺-K⁺-ATPase activity in cultured human non-pigmented ciliary epithelial cells.

Schlüsselwörter

Isoproterenol - Na⁺-K⁺-ATPase - Ziliarkörperepithel - Kammerwasser - β-adrenerger Rezeptor

Key words

Glaucoma - intraocular pressure - β-blockers - aqueous humor production

1 ¹ Swiss National Science Foundation grant #32-52783.97 and #32-061495.00 (Bern, Switzerland), Velux Foundation (Zurich, Switzerland), Schwickert Foundation (Basel, Switzerland), and Roche Research Foundation (Basel, Switzerland).

References

1 ¹ Swiss National Science Foundation grant #32-52783.97 and #32-061495.00 (Bern, Switzerland), Velux Foundation (Zurich, Switzerland), Schwickert Foundation (Basel, Switzerland), and Roche Research Foundation (Basel, Switzerland).

• 01 Krupin  T, Civan  M M. Physiologic basis of aqueous humor formation. In: Ritch R, Sields MB, Krupin T. The glaucomas. Mosby, St. Louis; 1996: 251-280
• 02 Okisaka  S, Kuwabara  T, Rapoport  S. Selective destruction of the pigmented epithelium in the ciliary body of the eye.  Science. 1974;  184 1298-1299
• 03 Usukura  J, Fain  G, Bok  D. 3H-ouabain localization of Na-K-ATPase in the epithelium of the rabbit ciliary body pars plicata.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1988;  29 606-614
• 04 Coca-Prados  M, Fernàndez-Cabezudo  J, Sànchez-Torres  J, Crabb  W, Ghosh  S. Cell-specific expression of the human Na⁺, K⁺-ATPase μ₂ subunit isoform in the nonpigmented ciliary epithelium.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995;  36 2717-2728
• 05 Becker  B. Vanadate and aqueous humor dynamics.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1980;  19 1156-1165
• 06 Coca-Prados  M, Wax  B. Transformation of human ciliary epithelial cells by simian 40: induction of cell proliferation and retention of μ₂-adrenergic receptors.  Proc Natl Acad Sci USA. 1986;  83 8754-8758
• 07 Riese  K, Beyer  A T, Lui  G M, Crook  R B. Dopamine D1 stimulation of Na⁺,K⁺,Cl^- cotransport in human NPE cells: effects of multiple hormones.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;  39 1444-1452
• 08 Longo  N, Griffin  D L, Louis  E J. A simple method for evaluation of Rb⁺ transport and Na⁺-K⁺ pump stoichiometry in adherent cells.  Am J Physiol. 1991;  29 C1341-C1346
• 09 Rittenhouse  D K, Pollack  M G. Pharmacodynamics of beta-blocker modulation of aqueous humor production.  Exp Eye Res. 2000;  70 429-439
• 10 Mittag  T. Adrenergic and dopaminergic drugs in glaucoma. In: Ritch R, Sields MB, Krupin T. The glaucomas. Mosby, St. Louis; 1996: 1409-1424
• 11 Brubaker  F R. Flow of aqueous humor in humans.  Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991;  32 3145-3166