Aflibercept-Transport in und durch retinale Endothelzellen: Spielt der neonatale Fc-Rezeptor dabei eine Rolle?!

Verschiedene Erkrankungen des hinteren Augenabschnittes wie das Makulaödem in Folge einer Diabetischen Retinopathie oder eines retinalen Venenverschlusses, oder Neovaskularisierung in Rahmen einer altersabhängigen Makuladegeneration sind mit der deregulierten Expression verschiedener Wachstumsfaktoren assoziiert. Von diesen hat VEGF-A eine besondere Bedeutung, und die intravitreale Injektion verschiedener VEGF-bindender Proteine ist inzwischen eine Standardtherapie.

Aflibercept gehört zu diesen VEGF-bindenden Proteinen: Das rekombinante Protein besitzt zwei VEGF-Bindungsdomänen der VEGF-Rezeptoren 1 und 2 fusioniert an den Fc-Terminus eines humanen IgG. Wir und andere konnten in verschiedenen in vitro-Studien mit (retinalen) Endothelzellen zeigen, dass Aflibercept durch VEGF stimulierte oder induzierte zelluläre Prozesse oder Eigenschaften hemmen und normalisieren kann. Zudem wird Aflibercept von retinalen Endothelzellen in vitro sowie in vivo nach intravitrealer Injektion in das nicht-humane Primatenauge aufgenommen; retinale Endothelzellen sind also möglicherweise am Transport von Aflibercept aus dem Auge beteiligt. Der neonatale Fc-Rezeptor (FcRn) ist für den Transport von IgG – und vermutlich auch von Fc-Fusionsproteinen wie Aflibercept – in und durch Endothelzellen von außerordentlicher Bedeutung. In frühen Endosomen lokalisiert, bindet er internalisiertes IgG und der FcRn-IgG Komplex wird an den Lysosomen vorbei entweder zur gegenüberliegenden Zellseite (→ Transcytose) oder zu der Seite der Aufnahme (→ Recycling) transportiert; die Freisetzung des IgG erfolgt dann durch Exozytose. Dadurch wird der Abbau von IgG in den Lysosomen verhindert. Retinale Endothelzellen exprimieren den FcRn, wobei seine Expression vermutlich durch Serumkomponenten aktiviert wird.

Wir haben jetzt an unserem etablierten Modell immortalisierter Endothelzellen aus der Rinderretina (iBREC) untersucht, ob und wie der FcRn in den Transport von Aflibercept involviert ist.

Nach temperaturabhängiger Aufnahme durch iBREC ist Aflibercept in sogenannten frühen Endosomen lokalisiert, in denen auch der FcRn vermutet wird. Im Einklang mit dieser Beobachtung wird Aflibercept zusammen mit Proteinen aus Membranen und Organellen ko-extrahiert, unabhängig davon, ob die Zellen mit oder ohne Serum kultiviert wurden. Nur nach Kultivierung der Zellen ohne Serum, werden große Mengen von Aflibercept zusammen mit Zytosklettproteinen extrahiert, außerdem ist der Transport durch die iBREC-Schicht deutlich verlangsamt. Diese reversible Akkumulation beruht vermutlich auf einer Hemmung des intrazellulären Transports unter diesen Bedingungen. Verhindert man die Bindung zwischen dem Fc-Terminus von Aflibercept und dem FcRn in Anwesenheit von Protein A, das an den Fc-Terminus bindet, oder mit einem Antikörper, der FcRn inaktiviert, dann ist die Aufnahme von Aflibercept sowie sein Transport deutlich verringert. Vermutlich wird Aflibercept unter diesen Bedingungen aufgenommen und dann abgebaut. Hemmung des FcRn-vermittelten IgG-Transportes mit LY294002 führt ebenfalls zur Verlangsamung des Aflibercept- Transportes, aber nicht zu einer Veränderung der intrazellulären Lokalisation und Menge von Aflibercept.

Abb. 1: FcRn-bindender Antikörper 1G3 hemmt Transport und verringert intrazelluläre Menge von Aflibercept. (Daten Aflibercept und Actin aus: Deissler HL, Lang GK, Lang GE. Exp Eye Res 2017; 154: 39–46)

Die Ergebnisse unserer in vitro-Studie legen also die Schlussfolgerung nahe, dass bei der Aufnahme von Aflibercept durch iBREC der FcRn eher keine Rolle spielt, aber maßgeblich an Aflibercepts intrazellulärem Transport beteiligt ist.