Digital holographische Mikroskopie zur Beurteilung der experimentellen DSS Colitis und zur Quantifizierung von Zellmigration und -proliferation in vitro

Einführung: Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) stellen für die betroffenen, meist jungen Patienten eine große Bürde dar. Die Dextran Sodium Sulfat (DSS)-induzierte Colitis ist ein etabliertes murines experimentelles Kolitismodell zur präklinischen Evaluation potentieller Wirksubstanzen. Die digital-holographische Mikroskopie (DHM) erlaubt eine markerfreie quantitative Phasenkontrastdarstellung und ermöglicht somit die valide Beurteilung von Zelldicke und Gewebsdichte. Ziel unserer Studie war es, die DHM zur Erfassung der DSS-Colitisaktivität und zur objektiven Quantifizierung von „Wound-Healing-Assays“ zu evaluieren.

Methodik: Die DSS-Colitis wurde in CL57/B6 WT Mäusen induziert. Kryofixierte Schnitte (5 µm) von gesunden und kranken Tieren wurde mittels DHM untersucht (n = 10 pro Gruppe). Zur Beurteilung der Gewebsdichte wurden segmentale Messungen der optischen Weglängenverkürzung (= Brechungsindex (RI)) entsprechend der anatomischen Wandschichtung des Colons (Epithel (E), Submukosa (SM) und Stroma (ST)) durchgeführt (75 Messungen/Tier). Darüberhinaus wurden DHM-Zeitraffer-Aufnahmen von „Wound Assays“ (Caco-2-Zellen und humanen intestinalen Fibroblasten) durchgeführt.

Ergebnisse: Der durchschnittliche RI unterschied sich signifikant zwischen den unterschiedlichen Wandschichten des Kolons (E: 1,372 ± 0,008, SM: 1,365 ± 0,014, ST: 1,378 ± 0,014; Mittelwerte ± Standardabweichung; p < 0,001). Der RI war zudem signifikant niedriger in der Colitis-Gruppe im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe, als Korrelat einer reduzierten Gewebsdichte (E: 1,368 ± 0,007 vs. 1,375 ± 0,008; p < 0,001, SM: 1,354 ± 0,007 vs. 1,376 ± 0,011; p < 0,001, ST: 1,375 ± 0,015 vs. 1,382 ± 0,013; p < 0,001). Darüberhinaus zeigte sich eine signifikante Korrelation des Brechungsindex mit dem relativen Gewichtsverlust und damit der Krankheitsschwere der betroffenen Tiere. Die DHM von Wound Assays erlaubt eine automatische Erfassung der Zellproliferation und -migration im zeitlichen Verlauf (Caco-2: T₁ (12h)= 34,2%, T₂ (24h)= 53,2% und Fibroblasten: T₁=(24h)= 15,0%, T₂=(48h)= 30,4% (Wachstum entlang der x-Achse).

Abb. 1

Schlussfolgerung: Die digital-holographische Mikroskopie detektiert zuverlässig Veränderungen der Gewebsdichte im Rahmen von entzündlichen Vorgängen der murinen Kolonmukosa und erlaubt eine valide Quantifizierung. Eine Unterscheidung zwischen entzündetem und gesundem Kolon ist somit auch ohne Anfärbung verlässlich möglich. Darüberhinaus können Zellwachstum- und -migration automatisiert erfasst werden und der Einfluss potentieller Wirksubstanzen in unterschiedlichen Zelllinien evaluiert werden.