Auflösung einer KEL1 Diskrepanz als Fallbeispiel der haplotypspezifischen Nanopore-Sequenzierung von Blutgruppengenen - Thun, Gian-Andri; Gueuning, Morgan; Merki, Yvonne; Niederberger, Nadine; Trost, Nadine; Sigurdardottir, Sonja; Engström, Charlotte; Mattle-Greminger, Maja P.; Meyer, Stefan (Transfusionsmedizin, 2024)
Aufgrund der starken Immunogenität des KEL1-Antigens ist dessen Erhebung oft Teil der routinemäßigen Spendertypisierung. Am Blutspendezentrum Zürich wird KEL1 serologisch als auch genetisch mittels Hochdurchsatzgenotypisierung bestimmt. Genotyp-Phänotypdiskrepanzen werden normalerweise durch eine aufwendige Sanger-Sequenzierung aller 19 Exons gelöst, welche jedoch keine Erstellung von Haplotypen zulässt. Hier präsentieren wir ein alternatives Vorgehen, das auf der neuesten Sequenzierungstechnologie von Oxford Nanopore Technologies basiert und die Generierung von Haplotypen ganzer Gene ermöglicht.Zur Ermittlung der KEL1-Expression kamen serologische Standardmethoden zur Anwendung. Vier Varianten innerhalb des KEL-Gens waren Teil der auf MALDI-TOF Massenspektrometrie basierenden Hochdurchsatz genotypisierung, darunter c.578C>T, welches die KEL1/2-Expression bestimmt. Die Bestätigung diskrepanter Ergebnisse erfolgte mittels PCR-SSP und serologischen Untersuchungen zur Antigenexpressionsstärke wie Adsorptions-Elutionsanalysen und Durchflusszytometrie. Zur Auflösung einer Diskrepanz bei einem Spender amplifizierten wir das ~21 kb lange KEL mit zwei sich um 4.4 kb überlappenden «long-range» PCRs von 12.7 kb und 14.3 kb Länge. Die Überlappung war dabei für die Haplotypisierung wesentlich. Die Nanopore-Sequenzierung der PCR-Amplifikate erfolgte auf einer Flongle flow cell, und die detektierten exonischen Varianten wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt.Wir identifizierten einen heterozygoten KEL*01/02-Blutspender mit einem KEL:-1,2 (K-k+) Phänotyp. Diese Diskrepanz wies auf ein Null-Allel (KEL*01N) hin. Die Analyse der Probe ergab eine bisher bei der ISBT noch nicht beschriebene Missense-Variante in Exon 11 (c.1241C>A, p.Thr414Lys, rs1384232704), welche dem KEL*01-Allel zugeordnet werden konnte. Da kein KEL1-Antigen auf der Oberfläche der Erythrozyten nachweisbar war, wurde die Genvariante als Null-Allel definiert.Mit Hilfe der Nanopore-Sequenzierung konnten wir eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Phänotyp innerhalb kurzer Zeit auflösen und ein neues KEL*01N-Allel beschreiben. Die Long-Read Technologie vereinfachte maßgeblich die Haplotypisierung des KEL-Gens und dies in einem kostengünstigen sowie zeitsparenden Verfahren, welches sich auch für die Abklärung von Genotyp-Phänotypdiskrepanzen in vielen anderen Blutgruppensystemen eignet.
Keywords: Blutgruppenallelbestimmung; Nanopore-Technologie; Haplotyp; Long-Read Sequenzierung