CD8+CD45RA+CD27-CD28-T-cell subset in PBL of cervical cancer patients representing CD8+T-cells being able to recognize cervical cancer associated antigens provided by HPV 16 E7

Abstract

Objective: In response to antigenic stimulation, naive MHC-class I restricted and antigen-specific CD8+CD45RA+CD28+T-cells undergo clonal expansion and differentiate into CD8+CD45RO+ memory T-cells. Upon re- encounter with the nominal antigen, CD45RO+ T-cells are able to convert to CD8+CD45RA+CD28-T-cells displaying potent immune effector functions, including TNF-α production. This T-cell subpopulation constitutes a minor population in healthy individuals. In the present study we are currently evaluating whether this particular T-cell subset in PBL represents CD8+T-cells which may be able to recognize cervical cancer associated antigens provided by HPV 16 E7.

Material and Methods: Flow-cytometric cell sorted CD8+CD45RA+CD28- and CD8+CD45RA+CD28-T-cells were obtained from patients with cervical cancer and tested for recognition of HLA-A2 restricted peptides derived from the human papillomavirus (HPV)16-E7 gene product using ELISA. HPV DNA in tumor tissue was detected by PCR.

Results: We show that the effector CD8+CD45RA+CD28-T-cell subset is expanded in peripheral blood lymphocytes (PBL) from patients with cervical cancer, but also in PBL from patients with an acute mycobacterial infection. CD8+T-cells from 3/6 cancer patients showed a peptide-specific immune response which could be segregated in peptide epitopes which elicited either a strong TNF-α production, or GM-CSF and IL-2 secretion. Peptide-reactivity could exclusively be detected in the ex vivo freshly isolated CD8+CD45RA+CD28-T-cell population. A similar situation was found to be true for HLA-A2 presented peptide epitopes derived from M. tuberculosis-associated antigens presented to T-cells obtained from patients with tuberculosis.

Conclusions: The sorting of CD8+CD45RA+CD28-T-cells enables to determine the fine specificity of CD8+ effector T-cells without the need for in vitro manipulation and aids to define the most appropriate target epitopes for novel vaccine designs.

Zusammenfassung

Fragestellung: Im Rahmen einer Antigen-Stimulation könnenÂ’naive, MHC-Klasse I restringierte, antigen-spezifische CD8+CD45RA+CD28+T-Zellen proliferieren und sich in CD8+CD45RO+Gedächtniszellen differenzieren. Nach erneuter Antigen-Stimulation können sich diese Gedächtniszellen in CD45RA+CD28-Effektorzellen transformieren. Bei gesunden Probanden lässt sich diese T-Zell-Subpopulation nur in vergleichsweise geringem Umfang nachweisen. In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob periphere CD8+T-Zellen bei Patientinnen mit Gebärmutterhalskrebs entsprechende Effektorzellen repräsentieren, die in der Lage sind, Tumor- assoziierte Epitope von HPV 16 E7 spezifisch zu erkennen.

Material und Methode: Aus Blutproben von HLA-A2 positiven Zervixkarzinompatientinnen wurden CD8+CD45RA+CD28+/-T-Zellen flowzytometrisch sortiert und mittels ELISA hinsichtlich ihrer spezifischen Immunreaktivität gegenüber HLA-A2 restringierten Peptiden von HPV16 E7 getestet. Mithilfe der PCR wurde HPV DNA im Tumorgewebe detektiert.

Ergebnisse: Wir können zeigen, dass CD8+CD45RA+CD28-Effektorzellen im Blut von Zervixkarzinompatientinnen klonal expandiert sind. Eine vergleichbare Reaktion lässt sich aber auch bei Patienten mit florider Lungentuberkulose (Kontrolle) evaluieren. Bei 3 von 6 Tumorpatientinnen ließen sich gemessen an einer signifikanten Sekretion von TNF-α, GM-CSF und Interleukin 2 HPV 16 E7 spezifische CD8+T-Zellen nachweisen. Eine vergleichbare Peptid-spezifische Immunreaktion von CD8+T-Zellen auf HLA-A2 restringierte Epitope von M. tuberkulosis konnte auch bei Tuberkulosepatienten objektiviert werden.

Schlussfolgerungen: Die Sortierung von CD8+CD45RA+CD28-T-Zellen bietet die Möglichkeit, die spezifische Immunreaktivität von Effektorzellen direkt ex vivo zu evaluieren und möglicherweise geeignete Zielepitope für einen spezifischen Impfstoff zu definieren.

Key words

Cervical cancer - CD8+T-cells - HPV 16 - specific immunoreactivity

Schlüsselwörter

Zervixkarzinom - CD8+ T-Zellen - HPV 16 - spezifische Immunreaktivität

References

• 1 Ahmed R, Gray D. Immunological memory and protective immunity: understanding their relation.  Science. 1996;  272 54-60
• 2 Altman J D, Moss P A, Goulder P J, Barouch D H, M McHeyzer-Williams M G, Bell J I, McMichael A J, Davis M M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.  Science. 1996;  274 94-96
• 3 Appay V D, Nixon F, Donahoe S M, Gillespie G M, Dong T, King A, Ogg G S, Spiegel H M, Conlon C, Spina C A, Havlir D V, Richman D D, Waters A, Easterbrook P, McMichael A J, Rowland-Jones S L. HIV-specific CD8(+) T cells produce antiviral cytokines but are impaired in cytolytic function.  J Exp Med. 2000;  192 63-75
• 4 Champagne P, Ogg G S, King A S, Knabenhans C, Ellefsen K, Nobile M, Appay V, Rizzardi G P, Fleury S, Lipp M, Forster R, Rowland-Jones S, Sekaly R P, McMichael A J, Pantaleo G. Skewed maturation of memory HIV-specific CD8 T lymphocytes.  Nature. 2001;  410 106-111
• 5 Chen G, P. Shankar P, Lange C, Valdez H, Skolnik P R, Wu L, Manjunath N, Lieberman J. CD8 T cells specific for human immunodeficiency virus, Epstein-Barr virus, and cytomegalovirus lack molecules for homing to lymphoid sites of infection.  Blood. 2001;  98 156-64
• 6 Geluk A, van Meijgaarden K E, Franken K L, Drijfhout J W, D’Souza S, Necker A, Huygen K, Ottenhoff T H. Identification of major epitopes of Mycobacterium tuberculosis AG85B that are recognized by HLA-A*0201-restricted CD8+ T cells in HLA- transgenic mice and humans.  J Immunol. 2000;  165 6463-6471
• 7 Gomez A, Bourgault I, Gomard E, Picard F, Levy J P. 1989. Role of different lymphocyte subsets in human anti-viral T cell cultures.  Cell Immunol. 1989;  118 312-327
• 8 Hamann D, Baars P A, Rep M H, Hooibrink B, Kerkhof-Garde S R, Klein M R, van Lier R A. Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8+ T cells.  J Exp Med. 1997;  186 1407-1418
• 9 Jager E, Höhn H, Necker A, Förster R, Karbach J, Freitag K, Neukirch C, Castelli C, Salter R D, Knuth A, Maeurer M J. Peptide-specific CD8+ T-cell evolution in vivo: Response to peptide vaccination with Melan-A/MART-1. Int J Cancer 2001; in press
• 10 Kast W M, Brandt R M, Sidney J, Drijfhout J W, Kubo R T, Grey H M, Melief C J, Sette A. Role of HLA-A motifs in identification of potential CTL epitopes in human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.  J Immunol. 1994;  152 3904-3912
• 11 Kast W M, Feltkamp M C, Ressing M E, Vierboom M P, Brandt R M, Melief C J. 1996. Cellular immunity against human papillomavirus associated cervical cancer.  Semin Virol. 1996;  7 117-123
• 12 Kono K, Ressing M E, Brandt R M, Melief C J, Potkul R K, Andersson B, Petersson M, Kast W M, Kiessling R. Decreased expression of signal-transducing zeta chain in peripheral T cells and natural killer cells in patients with cervical cancer.  Clin Cancer Res. 1996;  2 1825-1828
• 13 Lee K H, Panelli M C, Kim C J, Riker A I, Bettinotti M P, Roden M M, Fetsch P, Abati A, Rosenberg S A, Marincola F M. 1998. Functional dissociation between local and systemic immune response during anti-melanoma peptide vaccination.  J Immunol. 1998;  161 4183-4194
• 14 McMichael A J, O’Callaghan C A. 1998. A new look at T cells.  J Exp Med. 1998;  187 1367-1371
• 15 Mohagheghpour N, Gammon D, Kawamura L M, van Vollenhoven A, Benike C J, Engleman E G. 1998. CTL response to Mycobacterium tuberculosis: identification of an immunogenic epitope in the 19-kDa lipoprotein.  J Immunol. 1998;  161 2400-2406
• 16 Pilch H, Günzel S, Schäffer U, Tanner B, Maeurer M, Knapstein P G. CD8+CD45RACD27-CD28- T cell subset: Human papillomavirus (HPV) associated expansion in patients with cervical cancer and its precursors.  Geburtsh Frauenheilk. 2000;  60(9) 464-468
• 17 Pittet M J, Speiser D E, Lienard D, Valmori D, Guillaume P, Dutoit V, Rimoldi D, Lejeune F, Cerottini J C, Romero P. 2001. Expansion and functional maturation of human tumor antigen-specific CD8+ T cells after vaccination with antigenic peptide.  Clin Cancer Res. 2001;  7 796s-803s
• 18 Ressing M E, Sette A, Brandt R M, Ruppert J, Wentworth P A, Hartman M, Oseroff C, Grey H M, Melief C J, Kast W M. 1995. Human CTL epitopes encoded by human papillomavirus type 16 E6 and E7 identified through in vivo and in vitro immunogenicity studies of HLA- A*0201-binding peptides.  J Immunol. 1995;  154 5934-5943
• 19 Roos M T, van Lier R A, Hamann D, Knol G J, Verhoofstad I, van Baarle D, Miedema F, Schellekens P T. Changes in the composition of circulating CD8+ T cell subsets during acute epstein-barr and human immunodeficiency virus infections in humans.  J Infect Dis. 2000;  182 451-458
• 20 Santin A D, Hermonat P L, Ravaggi A, Bellone S, Roman J J, Jayaprabhu S, Pecorelli S, Parham G P, Cannon M J. Expression of CD56 by human papillomavirus E7-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes correlates with increased intracellular perforin expression and enhanced cytotoxicity against HLA-A2-matched cervical tumor cells.  Clin Cancer Res. 2001;  7 804s-810s
• 21 Santi A D, Hermonat P L, Ravaggi A, Chiriva-Internati M, Zhan D, Pecorelli S, Parham G P, Cannon M J. Induction of human papillomavirus-specific CD4(+) and CD8(+) lymphocytes by E7-pulsed autologous dendritic cells in patients with human papillomavirus type 16- and 18-positive cervical cancer.  J Virol. 1999;  73 5402-5410
• 22 Smith S M, Brookes R, Klein M R, Malin A S, Lukey P T, King A S, Ogg G S, Hill A V, Dockrell H M. Human CD8+ CTL specific for the mycobacterial major secreted antigen 85A.  J Immunol. 2000;  165 7088-7095
• 23 van der Burg S H, Visseren M J, Brandt R M, Kast W M, Melief C J. Immunogenicity of peptides bound to MHC class I molecules depends on the MHC-peptide complex stability.  J Immunol. 1996;  156 3308-3314
• 24 Weekes M P, Carmichael A J, Wills M R, Mynard K, Sissons J G. 1999. Human CD28-CD8+ T cells contain greatly expanded functional virus- specific memory CTL clones.  J Immunol. 1999;  162 7569-7577
• 25 Westermann J, Pabst R. Lymphocyte subsets in the blood: a diagnostic window on the lymphoid system?.  Immunol Today. 1990;  11 406-410