Regulation of the Cellular Transport and Compactation of Thyroglobulin

Summary

The cellular transport of thyroglobulin in thyrocytes is a TSH-regulated process and characterized by a bidirectional export-, storage- and recapture pathway. The regulation of single steps in this pathway is unclear, but a possible basis for this transport appeared to be the presence of the lysosomal targetting, signal mannose-6-phosphate (M6P), on porcine thyroglobulin [1] and the detection of the cation-dependent M6P-receptor on the apical cell surface and the Golgi-complex in thyrocytes [2]. The question arose, why thyroglobulin is not directed on an intracellular pathway to lysosomes thereby following the route characteristic of lysosomal enzymes. Recent observations have shown that the affinity of thyroglobulin to the M6P-receptor is very low and the receptor is presumably not effective in thyrocytes to direct thyroglobulin to lysosomes. Instead, a low affinity binding site for thyroglobulin has been found to operate on the surface of thyrocytes [3]. This receptor is specific for thyroglobulin and is saturable at 8 — 13 mg thyroglobulin per ml (5—9 µM). The highest affinity of thyroglobulin was that to itself which is the basis for the positive cooperation observed during binding of thyroglobulin to thyrocyte membranes. The receptor has a relative molecular mass of 46 kDa but is not identical with the cation-dependent M6P-receptor.

Because of the high-thyroglobulin-concentration in the folliclelumen (100—400mg/ml) it has always been argued that there is no need for the presence of a thyroglobulin receptor. It is wellknown, however, that thyroglobulin has a low diffusion rate in the follicle lumen and that it may take months until newly synthesized thyroglobulin exported into the follicle lumen reaches equilibrium distribution within the luminal cavity [4]. The low diffusion rate might be explained by the high viscosity of thyroglobulin in the follicle lumen [4]. In addition, we have shown that thyroglobulin in the follicle lumen appears to be structurally organized and that the luminal content can be isolated from tissue homogenates in an intact state [5]. These thyroid-globules are insoluble and they represent in form and surface characteristics a precise replica of the follicle lumen. About 75 % of the thyroglobulin is covalently cross-linked by non-disulfide crossbridges. About 22% are connected by intermolecular disulfide bridges whereas only 3% appear loosely incorporated into the globule matrix. These results show that thyroglobulin is present in part in an insoluble state. The isolated globulis may be the structural basis for the “last come, first served concept” which describes the sorting of freshly exported thyroglobulin from its storage form [6]. The results show also that thyroglobulin is not available for endocytosis in the known concentrations (see above). For rapid mobilization of insoluble thyroglobulin we postulate mechanism, possibly the presence of proteases, which are able to partially solubilize the luminal content to allow endocytosis of thyroglobulin.

Zusammenfassung

Der zelluläre Transport von Thyreoglobu-lin in Schilddrüsenzellen ist ein TSH-regulierter Prozeß und durch einen komplexen bidirektionalen Export-, Speicher- und Endocytose-Weg gekennzeichnet. Die Regulation der einzelnen Schritte dieses Transportweges ist unklar. Eine wichtige Grundlage schien gegeben zu sein, als die Phosphorylierung von Thyreoglobulin und die Anwesenheit eines Mannose-6-Pho-sphat-Signals im Thyreoglobulin-Molekül beschrieben wurden [1]. Dieses Signal könnte die Grundlage für den gerichteten Transport von Thyreoglobulin zu Lysosomen sein, zumal sich gezeigt hat, daß der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (M6PR) in Schilddrüsenzellen im Golgi-Komplex und auf der apikalen Plasma-Membran nachweisbar ist [2]. Es ergab sich allerdings die Frage, warum Thyreoglobulin mit Hilfe des M6PR nicht dem direkten intrazellulären Transportweg lysosomaler Enzyme folgt, sondern das lysosomale Kompartiment über den Export-, Speicher- und Endocytose-Weg erreicht. Die Antwort liegt vermutlich in der zu geringen Affinität von Thyreoglobulin zu M6PR in Schilddrüsenzellen. Es wird daraus geschlossen, daß der M6PR in Thyreozyten wahrscheinlich zu keiner Phase des zellulären Transportes von Thyreoglobulin wirksam ist [3]. Stattdessen scheint ein davon unabhängiger Rezeptor oder Rezeptor-Komplex wirksam zu sein, der extrazelluläres Thyreoglobulin zu binden vermag und die Endocytose für den lysosomalen Abbau und die Hormonfreisetzung vermittelt. Die Sättigung dieses Rezeptors wurde erst bei 8 bis 13 mg Thyreoglobulin pro ml (5 — 9 µM) erreicht. Der Rezeptor ist zwar spezifisch für Thyreoglobulin, arbeitet aber auf der Grundlage einer „low affinity binding site”. Die höchste Affinität scheint Thyreoglobulin zu sich selbst zu haben. Diese Neigung ist die Grundlage für eine positive Kooperation bei der Bindung von Thyreoglobulin.Für den Rezeptor wurde ein Molekulargewicht von 46 kDa ermittelt. Eine Beziehung zum Kationen-abhängigen M6PR konnte ausgeschlossen werden [3].

Die Notwendigkeit für einen Thyreoglobulin-Rezeptor scheint angesichts der hohen Thyreoglobulin-Konzentration im Follikel-Lumen überflüssig zu sein. Es ist jedoch bekannt, daß Thyreoglobulin im Follikel-Lumen eine sehr niedrige Diffusionsrate hat, die teilweise durch TSH reguliert ist. In nichtstimulierten Schilddrüsen kann es Monate dauern, bis neusyntheti siertes und exportiertes Thyreoglobulin eine gleichmäßige Verteilung im Follikel-Lumen erreicht [4]. Die niedrige Diffusionsrate kßnnte durch die hohe Viskosität von Thyreoglobulin im Follikel-Lumen erklärt werden [4]. Es hat sich aber gezeigt, daß das Thyreoglobulin im Follikel-Lumen zum Teil strukturell organisiert ist und der luminale Inhalt intakt aus Gewebehormon in Raten isoliert werden kann [5]. Die isolierten Schilddrüsen-Globuli sind in Form und Oberflächenstruktur ein exakter Ausguß des Follikel-Lumens. Sie sind praktisch unlßslich, weil Thyreoglobulin in diesem Globuli zu 75 % ko valent vernetzt ist. Etwa 22 % des globulären Thyreoglobulins sind durch intermolekulare Disulfid-Brücken verbunden, während nur ein geringer Anteil (etwa 3 %) lose inkorporiert ist [5]. Diese Beobachtungen zeigen, daß Thyreoglobulin in einer zum Teil unlßslichen Speicherform vorliegt. Sie geben außerdem eine strukturelle Erklärung für das „last come, first served concept” [6], wonach neu exportiertes Thyreoglobulin zuerst endocytiert wird, während die vorher sezernierte Speicherform erst bei gesteigertem Hormon-Bedarf mobilisiert wird. Die Kompaktierung und Quervernetzung von Thyreoglobulin wird deshalb als die strukturelle Grundlage für das „Sorting” des lßslichen Thyreoglobulins von seiner Speicherform angesehen. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Thyreoglobulin in der bekannten hohen luminalen Konzentration für die Endocytose nicht frei verfügbar ist, und die aktuelle Konzentration des ungebundenen Thyreoglobulins sehr viel geringer ist, als bisher angenommen wurde. Die kovalente Quervernetzung von Thyreoglobulin macht es außerdem erforderlich, daß bereits extrazellulär im Follikel-Lumen eine partielle Proteolyse stattfindet, um Endocytose und intrazelluläre Degradation von Thyreoglobulin zu ermßglichen.