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DOI: 10.1055/s-2006-944300
Ca2+-signaling in glatten Muskelzellen der Luftwege in T-bet Knock-Out Mäusen
Ca2+-signaling in Smooth Muscles Cells of the Airways in T-bet Knock-Out Mice
Dr. med. Albrecht Bergner
Pneumologie, Medizinische Klinik-Innenstadt
Ziemssenstr. 1
80336 München
Email: albrecht.bergner@med.uni-muenchen.de
Publication History
Publication Date:
16 November 2006 (online)
- Zusammenfassung
- Abstract
- Einleitung
- Material und Methoden
- Ergebnisse
- Diskussion
- Danksagung
- Literatur
Zusammenfassung
Hintergrund: Glatte Muskelzellen der Luftwege (ASMC) spielen in der bronchialen Hyperreagibilität eine entscheidende Rolle. Kalzium ist der wichtigste Faktor in der Signalkaskade, die die Kontraktion der ASMC bewirkt. T-bet knock-out (KO)-Mäuse zeigen spontan eine Dominanz von TH2-Lymphozyten sowie histologische und funktionelle Eigenschaften des Asthma bronchiale. Ziel unserer Untersuchung war die Beantwortung der Frage, ob die Ca2+-Homöostase in ASMC von T-bet KO-Mäusen als einem experimentellen Modell für das Asthma bronchiale verändert ist. Methode: Lungenschnitte von 100 - 200 µm Dicke wurden von T-bet KO- und Wildtyp-Mäusen kultiviert. Die Azetylcholin (ACH)-induzierte bronchiale Kontraktion wurde mittels Video-Mikroskopie quantifiziert und das ACH-induzierte Ca2+-signaling einzelner ASMC in den Lungenschnitten mittels 2-Photonen-Mikroskopie analysiert. Ergebnisse: Bronchien von T-bet KO-Mäusen zeigten einen erhöhten basalen Tonus, der mit vermehrten spontanen Änderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration der ASMC verbunden war. Im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen waren Bronchien von T-bet KO-Mäusen zudem hyperreagibel. Dies korrelierte mit erhöhten ACH-induzierten Ca2+-Transienten und einem erhöhten Prozentsatz von ASMC, die ACH-induzierte Ca2+-Oszillationen aufwiesen. Nach der Entleerung der intrazellulären Ca2+-Speicher durch Caffeine or Cyclopiazonic Acid war der Ca2+-Anstieg in ASMC von T-bet KO-Mäusen höher als in Wildtyp-Mäusen. Schlussfolgerungen: Eine veränderte Ca2+-Homöostase von ASMC trägt zu dem erhöhten basalen Bronchotonus und zur bronchialen Hyperreagibilität in Lungenschnitten von T-bet KO-Mäusen bei. Dem liegt wahrscheinlich ein erhöhter Ca2+-Gehalt der intrazellulären Ca2+-Speicher zu Grunde.
#Abstract
Background: Airway smooth muscle cells (ASMC) play a key role in bronchial hyperresponsiveness (BHR). A major component of the signalling cascade leading to ASMC contraction is calcium. T-bet knock-out (KO) mice show the key features of allergic asthma such as a shift towards TH2-lymphocytes and display a broad spectrum of asthma-like histological and functional characteristics. In this study, we aimed at investigating whether Ca2+-homeostasis of ASMC is altered in T-bet KO-mice as an experimental model of asthma. Methods: Lung slices of 100 to 200 µm thickness were obtained from T-bet KO- and wild-type mice. Airway contractions in response to acetylcholine (ACH) were measured by video-microscopy and Ca2+-signaling in single ASMC of lung slices was assessed using two-photon microscopy. Results: Airways from T-bet KO-mice showed increased baseline airway tone (BAT) and BHR compared to those of wild-type mice. The increased BAT was correlated with an increased incidence of spontaneous changes in intracellular Ca2+-concentrations, whereas BHR correlated with higher ACH-induced Ca2+-transients and an increased proportion of ASMC showing Ca2+-oscillations. Emptying intracellular Ca2+-stores using caffeine or cyclopiazonic acid induced higher Ca2+-elevations in ASMC from T-bet KO compared to wild-type mice.Conclusions:Altered Ca2+-homeostasis of ASMC contributes to increased BAT and BHR in lung slices from T-bet KO mice as a murine asthma model. We propose that a higher Ca2+-content of the intracellular Ca2+-stores is involved in the pathophysiology of these changes.
#Einleitung
Asthma ist charakterisiert durch Entzündung, Airway Remodelling und bronchiale Hyperreagibilität (BHR). Glatte Muskelzellen der Luftwege (ASMC) vermitteln die Bronchokonstriktion und spielen daher eine Schlüsselrolle in der BHR. Eine erhöhte Masse der ASMC ist bei Asthma nachgewiesen worden [1], darüber hinaus stellt sich jedoch die Frage, ob die Kontraktilität der einzelnen ASMC ebenfalls verändert ist. In diesem Zusammenhang ist die Rolle von Signalmolekülen, die die agonist-induzierte Kontraktion vermitteln, in den Mittelpunkt des Interesses gerückt [2]. Kalzium ist ein ubiquitäres Signalmolekül, das in der Regulation einer Vielfalt von Prozessen in nahezu allen Säugetierzellen involviert ist [3]. Kontraktile Stimuli erhöhen die Konzentration des zytoplasmatischen Ca2+ ([Ca2+]c) in ASMC und induzieren dadurch die Kontraktion. Auf diesem Hintergrund wird das agonist-induzierte Ca2+-signaling als ein mögliches Target in der Pathophysiologie der BHR angesehen. Ziel unserer Untersuchung war die Beantwortung der Frage, ob die Ca2+-Homöostase von ASMC bei BHR verändert ist.
T-bet ist ein TH1-spezifischer Transkriptionsfaktor, der die Eigenschaft hat, die Differenzierung vonTH2- in TH1-Lymphozyten initiieren zu können [4]. Naïve Mäuse, bei denen das T-bet Gen target deleted ist (T-bet KO-Mäuse), entwickeln spontan ein Airway Remodelling, das multiple inflammatorische wie auch funktionelle Charakteristiken des Asthmas aufweist [5]. T-bet KO-Mäuse stellen daher ein vielschichtiges, auf der anderen Seite aber auch einfach zu handhabendes Asthma-Modell dar, da die Notwendigkeit einer Allergenprovokation entfällt.
Lungenschnitte von 100 - 200 µm Dicke erhalten in Kultur die in situ Organisation der Lunge sowie die Kontraktilität der ASMC über mehrere Tage ([Abb. 1] u. [2], für Details siehe [6] [7] [8]) und sind daher hervorragend geeignet, um eine Vielzahl von Fragestellungen in einem in vivo nahen Modell zu untersuchen. Die [Ca2+]c in den ASMC wird mittels Ca2+-Indikatoren gemessen, wobei die Fluoreszenzintensität mit der [Ca2+]c korreliert. Konventionelle Fluoreszenz-Mikroskopie kann in Lungenschnitten nicht verwendet werden, da in dem dreidimensionalen Modell Fluoreszenz einzelner Zellen nicht unterschieden werden kann. Bei einem 2-Photonen-Laser-Mikroskop wird Fluoreszenz nur in der optischen Ebene erzeugt, wo durch Fokussierung des Laserstrahles die Dichte von Photonen hoch genug ist, damit Fluoreszenzmoleküle durch 2 Photonen gleichzeitig angeregt werden [9]. Dies ist Voraussetzung für eine ausreichende Anregungsenergie. Hierdurch kann Emissionslicht aus einer optischen Schicht mit einer Dicke von ca. 100 nm detektiert und Fluoreszenz einzelner Zellen diskriminiert werden.
In der vorliegenden Studie konnten wir zeigen, dass eine veränderte Ca2+-Homöostase von ASMC zur BHR beiträgt und das diesem Phänomen wahrscheinlich ein erhöhter Ca2+-Gehalt der intrazellulären Ca2+-Speicher zu Grunde liegt. Kalzium als intrazelluläres Signalmolekül könnte daher in Zukunft einen neuen, bislang vernachlässigten therapeutischen Ansatzpunkt darstellen.
#Material und Methoden
Für Details der Methodik siehe [6] [10] [11]. Zur Herstellung der Lungenschnitte wurden Mäuselungen mit bei 37 °C flüssiger Agarose gefüllt, die Lungen durch Verfestigung der Agarose bei 4 °C versteift und mittels eines Tissue Slicers Schnitte von 100 - 200 µm Dicke angefertigt. Die Lungenschnitte wurden frei schwimmend im Medium kultiviert und erhielten so die in situ Organisation des Lungengewebes und die Kontraktilität der ASMC für mindestens 5 Tage ([Abb. 1]). Die Azetylcholin (ACH)-induzierte Bronchokonstriktion ([Abb. 2]) und die durch eine Relaxationslösung (10 - 3 M β-Escin and 10 - 7 M ATP in Ca2+-freiem Phosphat-gepuffertem NaCl 0,9 % mit 0,02 % EDTA) induzierte Bronchorelaxation wurden mittels Videomikroskopie quantifiziert. Für Ca2+-Messungen wurden die Lungenschnitte mit dem Ca2+-Indikator Fluo-4-AM inkubiert und die Fluoreszenz einzelner ASMC mittels eines 2-Photonen-Mikroskopes quantifiziert. Zur statistischen Auswertung wurden der One-way beziehungsweise Two-way ANOVA oder ANOVA On Ranks (kombiniert mit Pairwise Multiple Comparisons) benutzt. Ein P-Wert von < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
#Ergebnisse
Bronchien in Lungenschnitten wurden einer Relaxationslösung ausgesetzt, mittels Videomikroskopie aufgezeichnet und die resultierende Bronchodilatation wurde als basaler Tonus definiert. Bronchien von T-bet KO-Mäusen zeigten einen erhöhten basalen Tonus ([Abb. 3a]). Weiterhin wurde die Azetylcholin (ACH)-induzierte Kontraktion von Bronchien in Lungenschnitten quantifiziert. Es zeigte sich, dass Bronchien von T-bet KO-Mäusen stärker kontrahierten als von Wildtyp Mäusen ([Abb. 3b]).
Um das dem basalen Tonus und der Kontraktion zu Grunde liegende Ca2+-signaling zu messen, wurden die Lungenschnitte mit dem Ca2+-Indikator Fluo-4-AM inkubiert und die Fluoreszenz in einzelnen ASMC in den Lungenschnitten mittels 2-Photonen Laser-Mikroskopie gemessen. Der erhöhte basale Tonus in den Bronchien von T-bet KO-Mäusen korrelierte mit einer erhöhten Inzidenz von spontanen Änderungen in der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]c) in den ASMC ([Abb. 4]). Das ACH-induzierte Ca2+-signaling ([Abb. 5]) bestand aus einem initialen Ca2+-Transienten, gefolgt von Ca2+-Oszillationen oder einem Ca2+-Plateau ([Abb. 6]). Die stärkere ACH-induzierte Kontraktion der Bronchien von T-bet KO-Mäusen korrelierte mit einem höheren Ca2+-Transienten und einem höheren Prozentsatz an ASMC, die Ca2+-Oszillationen zeigten ([Abb. 7]). Bei 10 - 6 M ACH zeigten jedoch nur noch 19 % der ASMC von T-bet KO-Mäusen Ca2+-Oszillationen, während 81 % ein Ca2+-Plateau aufwiesen. Die Frequenz der Ca2+-Oszillationen war nicht unterschiedlich.
Um die dem veränderten Ca2+-signaling zu Grunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, wurde der Ca2+-Gehalt der intrazellulären Ca2+-Speicher bestimmt, indem mittels Caffeine Ryanodine-Rezeptoren geöffnet oder mittels Cyclopiazonic Acid (CPA) SERCA-Pumpen inhibiert wurden. In beiden Fällen war der zu beobachtende Ca2+-Anstieg in ASMC von T-bet KO-Mäusen höher im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen ([Abb. 8]). Dies lässt auf einen höheren Ca2+-Gehalt der Ca2+-Speicher im asthmatischen Phänotyp schließen.
#Diskussion
Lungenschnitte erhalten in vitro die dreidimensionale Struktur der Lunge, die Zell-Zell-Interaktionen der verschiedenen pulmonalen Zelltypen und insbesondere die Kontraktilität der ASMC, eingebettet im bronchialen Gewebeverband. In unserer Untersuchung zeigte sich, dass Lungenschnitte von T-bet KO-Mäusen asthmatische Charakteristiken im Sinne eines erhöhten basalen Tonus und bronchialer Hyperreagibilität beibehalten.
Die Kontraktilität von Bronchien in Lungenschnitten ist bereits in der Vergangenheit mithilfe von Videomikroskopie untersucht worden (z. B. [12] [13]). Allerdings verhinderte die Dicke der Lungenschnitte, die andererseits deren „in vivo Nähe” ausmacht, Untersuchungen einzelner Zellen in dem dreidimensionalen Modell. Die 2-Photonen-Laser-Mikroskopie ist nun in der Lage, optisch dünne Schichten im Gewebe sichtbar zu machen [9]. Ein selbst zusammengestelltes 2-Photonen-Laser-Mikroskop ermöglichte es uns, das Ca2+-signaling in einzelnen ASMC in den Lungenschnitten zu untersuchen (für Einzelheiten siehe [11] [14] [15]). Hierbei zeigte es sich, dass auch ohne Stimulation mit Agonisten die ASMC spontane Schwankungen in der [Ca2+]c aufweisen, und wir konnten demonstrieren, dass der erhöhte basale Tonus mit einer erhöhten Inzidenz dieser spontanen Schwankungen korrelierte. Nach Stimulation mit Azetylcholin kommt es in den ASMC zu einem initialen Ca2+-Anstieg (Ca2+- Transient), der gefolgt ist von Ca2+-Oszillationen oder einem Ca2+- Plateau. In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass der Ca2+-Transient die Kontraktion bewirkt, während die Ca2+- Oszillationen die Kontraktion aufrechterhalten [6]. Tatsächlich korrelierte die bronchiale Hyperreagibilität mit einem erhöhten Ca2+-Transienten und mit einem erhöhten Prozentsatz an ASMC, die Ca2+-Oszillationen zeigten. Weiterhin legen unsere Daten nahe, dass ein erhöhter Ca2+-Gehalt der intrazellulären Ca2+-Speicher diesen Phänomenen zu Grunde liegt.
Für Ca2+-Kanal-Blocker wie zum Beispiel Nifedipin konnte in der Vergangenheit kein therapeutischer Nutzen beim Asthma bronchiale nachgewiesen werden [16]. Der Ca2+-Einstrom über die Zellmembran spielt bei der Kontraktion von ASMC jedoch allenfalls eine untergeordnete Rolle [6]. Daher ist die mangelnde Effektivität von Ca2+-Kanal-Blockern verständlich. Unsere Daten zeigen jedoch, dass die Ca2+-Homöostase von ASMC und hier insbesondere die intrazellulären Ca2+-Speicher eine zentrale Rolle in der bronchialen Hyperreagibilität spielen, und dies könnte in der Zukunft einen neuen therapeutischen Ansatz bilden.
#Danksagung
Unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft durch die Sachbeihilfen BE 2356/2 - 1 und BE 2356/2 - 3 an A. Bergner.
#Literatur
- 1 Martin J G, Duguet A, Eidelman D H. The contribution of airway smooth muscle to airway narrowing and airway hyperresponsiveness in disease. Eur Respir J. 2000; 16 349-354
- 2 Amrani Y, Tliba O, Deshpande D A. et al . Bronchial hyperresponsiveness: insights into new signaling molecules. Curr Opin Pharmacol. 2004; 4 230-234
- 3 Berridge M J, Bootman M D, Roderick H L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003; 4 517-529
- 4 Mullen A C, High F A, Hutchins A S. et al . Role of T-bet in commitment of TH1 cells before IL-12-dependent selection. Science. 2001; 292 1907-1910
- 5 Finotto S, Neurath M F, Glickman J N. et al . Development of spontaneous airway changes consistent with human asthma in mice lacking T-bet. Science. 2002; 295 336-338
- 6 Bergner A, Sanderson M J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 2002; 119 187-198
- 7 Bergner A, Sanderson M J. Airway hyperresponsiveness: From molecules to bedside - Selected contribution: Airway contractility and smooth muscle Ca2+-signaling in lung slices from different mouse strains. Journal of Applied Physiology. 2003; 95 1325-1332
- 8 Bergner A, Sanderson M J. ATP stimulates Ca2+-oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002; 283 L1271-L1279
- 9 Denk W, Strickler J H, Webb W W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 1990; 248 73-76
- 10 Bergner A, Kellner J, Kemp da Silva A. et al . Bronchial hyperreactivity is correlated with increased baseline airway tone. Eur J Med Res. 2006; 11 77-84
- 11 Bergner A, Kellner J, Kemp da Silva A. et al . Ca2+-signaling in airway smooth muscle cells is altered in T-bet knock-out mice. Respir Res. 2006; 7 33
- 12 Dandurand R J, Wang C G, Phillips N C. et al . Responsiveness of individual airways to methacholine in adult rat lung explants. J Appl Physiol. 1993; 75 364-72
- 13 Martin C, Uhlig S, Ullrich V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 1996; 9 2479-2487
- 14 Nguyen Q T, Callamaras N, Hsieh C. et al . Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 2001; 30 383-393
- 15 Sanderson M J, Parker I. Video-rate confocal microscopy. In: Biophotonics, a 2-Volume issue in Methods in Enzymology. Edited by Gerard Mariott and Ian Parker 2002
- 16 Massey K L, Hendeles L. Calcium antagonists in the management of asthma: breakthrough or ballyhoo?. Drug Intell Clin Pharm. 1987; 21 505-509
Dr. med. Albrecht Bergner
Pneumologie, Medizinische Klinik-Innenstadt
Ziemssenstr. 1
80336 München
Email: albrecht.bergner@med.uni-muenchen.de
Literatur
- 1 Martin J G, Duguet A, Eidelman D H. The contribution of airway smooth muscle to airway narrowing and airway hyperresponsiveness in disease. Eur Respir J. 2000; 16 349-354
- 2 Amrani Y, Tliba O, Deshpande D A. et al . Bronchial hyperresponsiveness: insights into new signaling molecules. Curr Opin Pharmacol. 2004; 4 230-234
- 3 Berridge M J, Bootman M D, Roderick H L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003; 4 517-529
- 4 Mullen A C, High F A, Hutchins A S. et al . Role of T-bet in commitment of TH1 cells before IL-12-dependent selection. Science. 2001; 292 1907-1910
- 5 Finotto S, Neurath M F, Glickman J N. et al . Development of spontaneous airway changes consistent with human asthma in mice lacking T-bet. Science. 2002; 295 336-338
- 6 Bergner A, Sanderson M J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 2002; 119 187-198
- 7 Bergner A, Sanderson M J. Airway hyperresponsiveness: From molecules to bedside - Selected contribution: Airway contractility and smooth muscle Ca2+-signaling in lung slices from different mouse strains. Journal of Applied Physiology. 2003; 95 1325-1332
- 8 Bergner A, Sanderson M J. ATP stimulates Ca2+-oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002; 283 L1271-L1279
- 9 Denk W, Strickler J H, Webb W W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 1990; 248 73-76
- 10 Bergner A, Kellner J, Kemp da Silva A. et al . Bronchial hyperreactivity is correlated with increased baseline airway tone. Eur J Med Res. 2006; 11 77-84
- 11 Bergner A, Kellner J, Kemp da Silva A. et al . Ca2+-signaling in airway smooth muscle cells is altered in T-bet knock-out mice. Respir Res. 2006; 7 33
- 12 Dandurand R J, Wang C G, Phillips N C. et al . Responsiveness of individual airways to methacholine in adult rat lung explants. J Appl Physiol. 1993; 75 364-72
- 13 Martin C, Uhlig S, Ullrich V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 1996; 9 2479-2487
- 14 Nguyen Q T, Callamaras N, Hsieh C. et al . Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 2001; 30 383-393
- 15 Sanderson M J, Parker I. Video-rate confocal microscopy. In: Biophotonics, a 2-Volume issue in Methods in Enzymology. Edited by Gerard Mariott and Ian Parker 2002
- 16 Massey K L, Hendeles L. Calcium antagonists in the management of asthma: breakthrough or ballyhoo?. Drug Intell Clin Pharm. 1987; 21 505-509
Dr. med. Albrecht Bergner
Pneumologie, Medizinische Klinik-Innenstadt
Ziemssenstr. 1
80336 München
Email: albrecht.bergner@med.uni-muenchen.de