Gräserpollen stellen die wichtigste Quelle von Außenluft-Allergenen dar. Die immunzytochemische
Darstellung von Allergenen in Gräserpollen ist immer noch weitgehend unzuverlässig,
obwohl einige Einzelarbeiten in diesem Bereich bekannt sind [1 2 3 4
Die Wiesenlieschgraspollen (Allergon, Välinge, Schweden) wurden wasserfrei entweder
mit Acrolein-Dampf (Riedel-de-Haën, Seelze) oder mit Mischungen aus Glutaraldehyd
(GA; 70 %, EM grade; Polysciences, Warrington, PA., USA) und Paraformaldehyd (PFA;
Sigma, St. Louis, Mo., USA) in 2,2-Dimethoxypropan (DMP; Sigma) fixiert. Eine Konzentration
von 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP 24 hr bei Raumtemperatur zeigte die besten Ergebnisse.
Zur Lokalisierung der Allergene in Pollen wurden Kryoschnitte, Semidünnschnitte und
gefriergebrochene Pollen mit monoklonalen Antikörpern (mAk IG 12 [5 6
Die Methoden zum Allergennachweis umfassten:
indirekte Immunfluoreszenz an Gefrierschnitten für lichtmikroskopische Verfahren,
indirekte Immungold-Silber-Markierung an Gefrierschnitten und gefriergebrochenen Pollen
für rasterelektronenmikroskopische Verfahren im JSM-6400F und JSM-6300 (JEOL, Tokyo,
Japan) mit Sekundärelektronen(SE)- und Rückstreu(RE)-Detektoren,
indirekte Immungold-Silber-Markierung an Kunstharz- (Epon, LR-Gold und Lowicryl K4M)Semidünnschnitten
für lichtmikroskopische und transmissionselektronenmikroskopische Verfahren.
Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Pollen nach Entwässerung in aufsteigender
Ethanolreihe und Kritisch-Punkt-Trocknung mit einer 10-nm-Goldschicht besputtert.
Lichtmikroskopische Untersuchungen am Semidünnschnitt erfolgten sowohl im Durchlicht
als auch mit Epipolarisation sowie am Kryoschnitt mit Epifluoreszenz. Die genauen
Verfahrensabläufe zeigt Abb. [1
Im Ergebnis zeigte sich die beste Morphologie nach Fixierung in 0,5 % GA + 0,5 % PFA
in DMP-24 hr bei RT. Es wurde keine positive Markierung gefunden bei Fixation mit
Acrolein-Dampf und auch nicht bei Fixation mit GA bzw. GA + PFA (in DMP) in Konzentrationen
> 0,5 % GA.
Eine detaillierte Analyse der bevorzugten Lokalisationsorte der von uns nachgewiesenen
Majorallergene Phl p 1 und Phl p 5 weist auf unterschiedliche Allergenverteilungsmuster
hin: Phl p 1 zeigt sich im Bereich der äußeren Anteile der Intine und an der Pollenoberfläche
im Porenbereich, während Phl p 5 vorwiegend in der zytoplasmatischen Matrix sowie
in Zwischenräumen und Mikrokanälen der Exine erscheint (Abb. [2
Auf der Pollenoberfläche war die Phl p 5-Markierung nicht über die ganze Oberfläche
gleichmäßig verteilt, sondern zwischen den Inseln des Tectums (spinulose exine) zu
finden. Die räumliche Expression von Phl p 5 nach der Immungoldmarkierung weist auf
eine „natürliche” Freisetzung der Allergene durch Mikrokanäle der Exine auf die Pollenoberfläche
hin.
Bei dieser Studie handelt es sich um
die erste komplexe Studie zum Vergleich verschiedener Fixations-, Einbettungs- und
Entwässerungsmethoden und Mikroskopieverfahren zur Darstellung von hochdiffusiblen
Allergenen in Gräserpollen
die erste Applikation der konventionellen- und Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie
zur intrazellulären 3D-Darstellung von Hauptallergenen in Pollen von Phleum pratense
L.
Abb. 1 Schematische Darstellung der angewendeten Methoden zum Allergennachweis in Pollen.
Abb. 2 Immungold-Silber-Markierung von Phl p 5 Majorallergen am Semidünnschnitt. Fixation
mit 0,5 % GA + 0,5 % PFA in DMP, LR-Gold-Einbettung bei -25 °C (Bild wurde publiziert:
Behrendt et al. Int Arch Allergy Immunol 1997; 113: 69).
