Die Rolle des innate immune systems in der Entwicklung der Lungenerkrankung bei zystischer Fibrose

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Einleitung

Die Forschung im Bereich der Zystischen Fibrose (Mukoviszidose, CF) in den letzten zehn Jahren hat prinzipielle Möglichkeiten und Einschränkungen des positional clonings von Krankheitsgenen aufgezeigt. Aus diesen Anstrengungen entstanden Konzepte zur Pathogenese dieser Erkrankung und zu Ansätzen für innovative Therapien. Studien in den 80er Jahren identifizierten zunächst einen Defekt der Chlorid-Leitfähigkeit respiratorischer Epithelzellen bei CF [[19]]. Ein Wendepunkt der CF-Forschung wurde vor genau zehn Jahren erreicht, als die Arbeitsgruppen von Tsui, Riordan und Collins [[20], [21]] das Gen isolierten, dessen Mutationen zur Entwicklung von CF führt. Analyse des vorhergesagten Translationsproduktes führte zu der Erkenntnis, daß das Gen für ein Transmembranprotein kodiert. Aufgrund der Verbindungen des genetischen Lokus mit Störungen des Salztransportes wurde das Protein cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) genannt. Die Identifizierung des Gens stimulierte eine Vielzahl von Studien mit dem Ziel, das Protein funktionell und biochemisch zu charakterisieren und die Verbindung zwischen Ausfall dieses Moleküls und der Entwicklung von CF zu verstehen. Initiale Gentherapieversuche an Patienten wurden innerhalb von vier Jahren von drei Gruppen begonnen [[25]]. Trotz des großen Fortschrittes im Bereich der CF-Forschung bleibt eine wichtige Frage unbeantwortet: Was ist die Beziehung zwischen Ausfall des CFTR und den klinischen Manifestationen der Erkrankung, die durch chronische Infektionen und progredientes pulmonales Versagen gekennzeichnet ist?

Quinton entdeckte als erster, daß der genetische Defekt bei CF Veränderungen des dünnen Flüssigkeitsfilms verursacht, der den Atemwegen aufliegt [[19]]. Eine wichtige Funktion der Schleimhaut der Atemwege liegt darin, Bakterien, die ständig inhaliert werden, abzutöten. Die chronische Infektion bei CF deutet darauf hin, daß diese Abwehrfunktion gestört ist. Die Validierung dieser Schlußfolgerung wurde durch die Gruppe vom Michael Welsh vorgelegt [[23]], die nachwies, daß Sekrete kultivierter CF-Atemwegszellen nicht in der Lage sind, Bakterien effizient abzutöten, was bei normalen Zellen der Fall ist. Dies stellte den genetischen Defekt des CFTR in direkten Zusammenhang mit dem Abwehrsystem der Atemwege. Dieser Artikel beschreibt dieses Abwehrsystem des menschlichen Respirationstraktes im Kontext der Pathogenese der Lungenerkrankungen bei CF.

Klinisch relevante Auswirkungen der Mutationen des CFTR sind vor allem in den Respirationsorganen zu finden. Die Lungen von CF-Patienten sind in utero und in der Neugeborenenzeit normal. Kurz nach der Geburt kommt es jedoch zur Kolonisierung mit Bakterien und zur Entwicklung einer chronischen Infektion, die mit einer ausgeprägten Entzündung einhergeht [[1]]. Die endobronchiale Kolonisierung ereignet sich normalerweise innerhalb der ersten beiden Lebensjahre [[2]], wobei initial Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, und gram-negative Organismen (Klebsiella pneumonia und Escherichia coli) vorherrschen. Die Rolle, die diese Bakterien bei der Entwicklung der Erkrankung spielen, bleibt unklar. Schließlich werden nahezu alle Patienten mit Pseudomonas aeruginosa infiziert. Dies ist eng mit einer Verschlechterung der Lungenfunktion assoziiert, wobei die Geschwindigkeit, mit der die Erkrankung fortschreitet, hochvariabel und multifaktoriell ist [[5]]. Organismen des Burkholderia cepacia-Komplexes stellen zunehmend wichtige Keime dar, deren Nachweis bei CF-Patienten eng mit einer schnellen klinischen Verschlechterung korreliert ist. Diese klinischen Daten weisen darauf hin, daß die Lungenerkrankung bei CF durch ein Versagen der Abwehrfunktion des Respirationstraktes verursacht ist. Die chronische Entzündung trägt zu einer obstruktiven Atemwegserkrankung bei und führt schließlich zur Zerstörung des Lungenparenchyms mit Organversagen.

Das Abwehrsystem der Lunge

Das innate immune system ist eine erste Barriere gegen pathogene Einflüsse und steht zeitlich und räumlich vor dem adaptiven Immunsystem mit der Aktivierung antigenspezifischer B- und T-Zellen. Das innate immune system stellt nicht nur einen ersten Schutz gegen Kolonisierung und Infektion dar, sondern aktiviert auch das adaptive Immunsystem und reguliert dessen Aktivität auch in qualitativer Hinsicht [[9]]. Im Respirationstrakt sind Komponenten dieses basalen Abwehrsystems durch andere Mechanismen ergänzt, um die Atemwege keimarm zu halten (Abb. [1]) [[24]].

Die mukoziliäre Clearance stellt einen effizienten Apparat dar, um pathogene Partikel zu eliminieren und arbeitet parallel mit der Filterfunktion der oberen Atemwege und mit Reflexen, wie Husten und Niesen. Schleim wird von mukösen Drüsenzellen und Becherzellen sezerniert und von den Zilien des respiratorischen Epithels transportiert. Alveolarmakrophagen, neutrophile Granulozyten und Epithelzellen stellen zelluläre Komponenten des innate immune systems dar. Diese Zellen haben nicht nur Effektorfunktion, sondern initiieren und koordinieren auch die Abwehrfunktionen gegenüber Infektionen (Abb. [1]).

Sekrete der Atemwege beinhalten Proteine und Peptide, die direkte antimikrobielle Funktion besitzen bzw. die Entzündungsreaktion modulieren (Abb. [1]). Diese Moleküle werden vom sekretorischen Apparat der Atemwege produziert, welcher aus den Drüsen und Becherzellen der großen Atemwege sowie Clara-Zellen der distalen Atemwege und Typ-II-Pneumozyten des Lungenparenchyms besteht. Klassische antimikrobielle Moleküle sind Lysozym, Laktoferrin, sekretorische Phospholipase A₂ und secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI). Weitere Substanzen, wie Komplement- oder Surfactant-Proteine und Clara-cell Protein (CC10, CCSP), besitzen ebenfalls Funktionen im Abwehrsystem [[24]].

In den letzten Jahren wurden antimikrobielle Peptide als mögliche Bestandteile des Abwehrapparates von Schleimhäuten entdeckt. Peptidantibiotika kommen im Tier- und Pflanzenreich vor und sind Produkte individueller Gene [[28]]. Die als Präpro-Peptide produzierten Moleküle werden nach Abspaltung des Präpro-Anteils als aktive Substanzen sezerniert und wirken durch Interaktionen mit Membranen der Mikroorganismen direkt antimikrobiell. Verschiedenen Klassen antimikrobieller Peptide, die sich in Aminosäuresequenz, Sekundärstruktur und Aktivitätsspektrum unterscheiden, wurden beschrieben. Eine der bestcharakterisierten Familien antimikrobieller Peptide sind Defensine. Defensine sind Moleküle mit breiter antimikrobieller Funktion und weisen einen hohen Anteil von Zysteinen auf [[10]]. α-Defensine sind insbesondere in sekretorischen Granula von Granulozyten lokalisiert, wo sie an nicht-oxidativen antibakteriellen Mechanismen teilhaben. Die ersten epithelialen β-Defensine, tracheal antimicrobial peptide (TAP) und lingual antimicrobial peptide (LAP) wurden im Rind gefunden [[8], [22]]. Homologe Substanzen des Menschen, human β-defensin 1 (hBD-1) und human β-defensin 2 (hBD-2), wurden isoliert [[6], [14]]. Diese β-Defensine werden im Oberflächenepithel und in Drüsen der Atemwege des Menschen und anderen Schleimhäuten gebildet [[3], [11]]. Eine andere Familie der Peptidantibiotika sind die Cathelizidine [[27]]. Diese Peptide besitzen eine hochkonservierte Signalsequenz und Proregion („cathelin”), ihre C-terminale Domäne, die das aktive Peptid darstellt, zeigt erhebliche Heterogenität und kann in der Länge von 12 bis 80 Aminosäuren messen [[13], [27]]. Das einzige Cathelizidin des Menschen, LL-37/hCAP-18, wurde aus Knochenmark isoliert [[13]]. LL-37/hCAP-18 ist in myeloischen Zellen exprimiert, wurde jedoch auch in entzündeter Haut nachgewiesen. In den Atemwegen wird das Peptid in Zellen des respiratorischen Epithels gebildet und in die Atemwegsflüssigkeit (airway surface fluid, ASF) sezerniert [[4]]. hBD-1 wird konstitutiv exprimiert, wogegen hBD-2 und LL-37/hCAP-18 durch inflammatorische Mediatoren hochreguliert werden.

Eine Abschätzung, wie groß der Beitrag ist, den ein einzelnes antimikrobielles Peptid oder Protein zur Abwehr leistet, ist schwierig. Mittels biochemischer Methoden wurden verschiedene aktive Moleküle isoliert. Funktionelle Untersuchungen beschränkten sich auf In-vitro-Experimente mit gereinigten Substanzen. Die tatsächlichen Konzentrationen antimikrobieller Peptide oder Proteine am Wirkungsort (d. h. in der Sol- oder Gel-Schicht der ASF) ist schwierig zu bestimmen, da das Sammeln der ASF technisch äußerst kompliziert ist. In der Lunge des Menschen sind ungefähr zwei Teelöffel Flüssigkeit über eine Fläche eines halben Fußballplatzes verteilt. Funktionelle Untersuchungen angereinigter Peptide oder Proteine spiegeln nicht notwendigerweise die komplexen Interaktionen einzelner individueller Komponenten, wie z. B. Agonismus und Antagonismus, wider. Im Abwehrsystem wirken verschiedene Gruppen antimikrobieller Peptide mit überlappenden Funktionen und Aktivitätsspektren zusammen. Diese Redundanz führt zu Schwierigkeiten, den Beitrag einer einzelnen Komponente zu untersuchen. Der Nachweis, daß antimikrobielle Peptide von Vertebraten wirklich antimikrobielle Funktionen in vivo besitzen, ist hauptsächlich indirekt. Genetische Methoden sind notwendig, um dies näher zu klären. Wir zeigten zum Beispiel, daß die antimikrobielle Aktivität der ASF, welche aus einem humanen bronchialen Xenograftmodell gewonnen wurde, durch die Applikation von Antisense-Oligonukleotiden spezifisch für hBD-1 gehemmt wurde [[11]]. Murine Homologe antimikrobieller Peptide des Menschen eröffnen wichtige Möglichkeiten genetische Strategien in Mausmodellen anzuwenden.

Abb. 1Abwehrmechanismen des respiratorischen Epithels. Husten und Zilienbewegung entfernen mechanisch eingeatmete Schmutzpartikel und Mikroorganismen, die im Schleim eingefangen wurden. Dieser Apparat wird als mukoziliäre Clearance zusammengefaßt. Verschiedene Substanzen mit pro- und antiinflammatorischen Eigenschaften werden von Epithelzellen sezerniert und funktionieren als Immunbarriere. Makrophagen, B- und T-Lymphozyten, neutrophile Granulozyten und Epithelzellen sind zelluläre Komponenten des innate und adaptiven Immunsystems.

Primäre und sekundäre Defekte des innate immune systems bei der Pathogenese der Lungenerkrankung bei CF

Eine Vielzahl von Hypothesen wurde vorgeschlagen, um zu erklären, wie ein Defekt des CFTR zum Ausfall des Abwehrsystems des Respirationstraktes führen kann und wie dies in einer chronischen Infektion der Lunge endet. Diese Hypothesen können in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die Hypothesen der ersten Gruppe gehen davon aus, daß der Defekt des CFTR zu Veränderungen des Salz- und Wasserhaushaltes der Atemwegssekrete führt, die sekundär Auswirkungen auf das Abwehrsystem haben. Boucher u. Mitarb. zeigten in verschiedenen Modellsystemen, daß CF-Epithel eine Hyperabsorption von Wasser aufweist. Dies führe zum Austrocknen der Sekrete und zu eingeschränkter mukoziliärer Clearance [[17]]. Diese „isotonic volume transport/mucus clearance” Hypothese verbindet den Defekt des CFTR direkt mit der Atemwegsinfektion. Eine andere Hypothese wurde durch Entdeckungen von Smith u. Mitarb. initiiert, die eine verminderte antimikrobielle Aktivität von CF ASF nachwiesen [[23]]. Als Verbindung zum CF-Phänotyp wurden Beobachtungen vorgeschlagen, nach denen der Salzgehalt der CF ASF auf Werte erhöht sei, die in In-vitro-Assays zur Inaktivierung antimikrobieller Substanzen führen. Die Beobachtung, daß die antimikrobielle Funktion von CF ASF durch Verminderung der Salzkonzentration gesteigert wird, machte diese Hypothese wahrscheinlich. Diese „hypotonic airway surface fluid/antimicrobial substance” Hypothese geht davon aus, daß der Defekt des CFTR in erhöhten Salzkonzentrationen resultiert, die dann die Funktion antimikrobieller Substanzen hemmen [[26]]. Die zentrale Aussage dieser Behauptung ist der erhöhte Salzgehalt der ASF, was kontrovers diskutiert wird. Eine detailliertere Diskussion über die Zusammensetzung der ASF kann in einer parallel erscheinenden Perspektive von Jeffery Wine nachgelesen werden.

Eine zweite Gruppe von Hypothesen schlägt vor, daß der Defekt des CFTR die Funktion von Zellen derartig stört, daß dies direkt zu Störungen der Abwehrfunktion führt. Die Biogenese oder Sekretion funktioneller antimikrobieller Substanzen kann durch intrazelluläre Störungen der Atemwegszellen gestört sein. Derzeit existieren allerdings keine Daten, die diese Hypothese belegen würden. Intrinsische Störungen des CF-Epithels wurden auch für veränderte Interaktionen mit Bakterien verantwortlich gemacht. Prince u. Mitarb. schlugen vor, daß Bakterien besser an CF-Atemwegszellen binden können, weil diese vermehrt Rezeptoren exprimieren, in diesem Fall das Tetrasaccharid von Asialogangliosid-1 (aGM1) [[15]]. Eine andere Hypothese, die aussagt, daß CFTR als Bindungsrezeptor für die Aufnahme von P. aeruginosa in Epithelzellen diene, wurde von Pier und Kollegen vorgeschlagen [[18]]. Die geringere Dichte von CFTR-Molekülen an der apikalen Membran von CF-Zellen würde somit zu herabgesetzter Clearance führen.

Einer der interessantesten Fakten im Rahmen der CF-Lungenerkrankung ist die Unfähigkeit des Abwehrsystems, trotz der starken Entzündungsreaktion eine initiale Kolonisation zu eliminieren. Diese Entzündungsreaktion ist durch den Einstrom von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sowie durch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-8 und TNFα, charakterisiert. Proteasen, Oxidantien und α-Defensine werden aus Entzündungszellen freigesetzt und tragen zu einer weiteren Zerstörung der Lungen bei. DNA aus lysierten Neutrophilen, Epithelzellen und Bakterien erhöht die Viskosität der Atemwegssekrete und führt zu einer weiteren Einschränkung der Clearancefunktion. Ausatemluft von CF-Patienten enthält weniger Stickoxid (NO) als die von Kontrollpersonen. Die Ursache dafür kann in einem erhöhten NO-Metabolismus oder in verminderter NO-Produktion, möglicherweise durch Verminderung der Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS), liegen [[12], [16]]. NO hat verschiedene Funktionen, die von der Regulation von Entzündungs- und Immunzellen und des Tonus glatter Muskelzellen bis hin zu direkter antimikrobieller Aktivität reichen. Ob die Wirkung von NO im Rahmen der CF-Lungenerkrankung positive oder negative Auswirkungen hat, ist wegen der vielfältigen Wechselwirkungen dieses Moleküls nicht bekannt. Trotz der beschriebenen Störung des innate immune systems scheint das adaptive Immunsystem intakt zu sein. Die meisten Patienten entwickeln Antikörper gegen Antigene von P. aeruginosa [[7]]. Spätere Stadien der Erkrankung sind durch eine chronische endobronchiale Infektion mit P. aeruginosa und anderen Organismen gekennzeichnet, was mit ständiger Mobilisierung des innate und des adaptativen Immunsystems einhergeht.

In den letzten zehn Jahren seit der Entdeckung des CF-Gens wurden große Fortschritte erzielt, die Verbindung zwischen dem Defekt des CFTR und der CF Lungenerkrankung zu verstehen. Der initiale Schritt nach der Geburt ist eine Kolonisation des Respirationstraktes, verursacht durch einen Defekt des basalen Abwehrsystems. Eine schwere und anhaltende Entzündungsreaktion entwickelt sich, die jedoch nicht in der Lage ist, die Infektion zu eliminieren. Die Mechanismen, die dieser Unfähigkeit des antigen-spezifischen (B- und T-Lymphozyten) und antigen-nicht-spezifischen Systems (neutrophile Granulozyten, Makrophagen, Epithelzellen) zugrunde liegen, ist nicht bekannt.

Auswirkungen auf die Entwicklung neuer Therapien

Fortschritte in der Erforschung der Pathogenese von CF wird die Entwicklung innovativer Therapien stimulieren. Ein Problem bei der Entwicklung neuer Therapieverfahren ist deren Evaluation in klinischen Studien. Die Demonstration tatsächlicher klinischer Effizienz (z. B. Besserung der Lungenfunktion, Verkürzung der Krankenhausaufenthaltsdauer, etc.) ist sehr schwierig. Surrogat-Endpunkte, wie beispielsweise die Korrektur elektrophysiologischer Parameter, sind oft inadäquat. Ein besseres Verständnis des Zusammenhangs zwischen Gendefekt und funktionellen Defekten, die durch klinisch erfaßbare Meßgrößen bestimmbar sind, wird die Entwicklung molekularer und funktioneller Marker fördern, die einfach zu messen sind und die die Wirksamkeit einer Therapie vorhersagen. Diese Entwicklungen dürften auch einen wichtigen Einfluß auf die Evaluation gentherapeutischer Ansätze haben, wo eine direkte Verbindung zwischen Genexpression und funktioneller Korrektur gemacht werden muß.

Die Feststellung, daß Peptidantibiotika in Körperoberflächen gebildet werden, hat Entwicklungen angeregt, diese oder ähnliche Substanzen als Therapeutika zu entwickeln. Colistin, ein antimikrobielles Peptid, welches aus Bakterien isoliert wurde, war das erste Peptidantibiotikum, welches in Aerosolform zur Behandlung von Atemwegsinfektionen bei CF eingesetzt wurde. Mehr Wissen über die biochemischen und funktionellen Eigenschaften endogener antimikrobieller Peptide von Säugern wird die Entwicklung einer zweiten Generation solcher Medikamente beschleunigen (Abb. [2]).

Abb. 2Schematischer Überblick über die Entwicklung der Lungenerkrankung bei CF. Ein Diagramm, welches die molekularen Veränderungen zeigt, ist jeweils neben einem histopathologischen Bild lokalisiert. Verschiedene Hypothesen wurden vorgeschlagen, die die Verbindung zwischen dem Ausfall des CFTR und der Entwicklung der Lungenerkrankung bei CF beschreiben. Bilder 1 und 2 vergleichen normale und CF-Atemwege. Im Vergleich zur normalen Situation (Bild 1) folgen aus dem Defekt des CFTR (Bild 2) eine Austrocknung der Atemwegssekrete mit eingeschränkter Clearance und nachfolgender Kolonisation [[1]]. CF-Epithelien könnten auch vermehrt Bindungsrezeptoren für Pseudomonas aeruginosa produzieren, wie z. B. asialoGM₁ (aGM₁) [[2]]. Dies würde zu einer gesteigerten Bindung dieses Mikroorganismus an das Epithel führen. CFTR an der apikalen Oberfläche von Zellen ist möglicherweise auch ein Bindungsrezeptor für P. aeruginosa mit der Funktion, dieses Bakterium aus dem Lumen der Atemwege zu eliminieren [[3]]. Antimikrobielle Substanzen werden in die wäßrige Sol-Phase sezerniert (4 und 5) und besitzen lokale bakterizide Aktivität. In der Situation bei CF kann die Sekretion dieser antimikrobiellen Substanzen behindert sein [[4]] oder sezernierte Substanzen können durch das CF-spezifische Milieu inaktiviert werden [[5]]. Der primäre Defekt der Abwehr resultiert in einer Infektion mit begleitender Entzündung. Die chronische Entzündung verursacht sekundäre Schäden am Abwehrsystem der Atemwege. Bild 3 zeigt chronisch infizierte CF-Atemwege mit zahlreichen Bakterien und neutrophilen Granulozyten, die sich in einer dicken Lage aus Schleim ansammeln. Entzündungs- und Epithelzellen produzieren proinflammatorische Zytokine sowie Proteasen. Bakterien setzen Proteasen, LPS und andere Virulenzfaktoren frei. Ein ausgeprägtes neutrophiles Infiltrat ist im Bereich des Interstitiums zu sehen. Bild 4 zeigt die charakteristische Zerstörung des Gewebes in späteren Stadien der Erkrankung. Das Epithel ist zum Teil abgeschilfert, das verbliebene Epithel zum Teil metaplastisch. Die intensive Entzündungsreaktion hält an und bleibt ihrer Natur nach akut neutrophil, anstelle in eine eher lymphozytäre Phase zu wechseln, was zu erwarten wäre.

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