ALK-Testung beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC): Immunhistochemie (IHC) und/oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)?^[*]

Alterationen der Anaplastischen Lymphoma Kinase (ALK) kommen bei ca. 3 – 4 % der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome (NSCLC) vor. Durch die Zulassungen des ALK (MET/ROS1)-Inhibitors Crizotinib (Food and Drug Administration [FDA] 2011; European Medicines Agency [EMA] 2012) sowie des ALK/IGF1-Inhibitors Ceritinib (FDA 2014, EMA 2015; Einsatz bei Tumorprogress unter Crizotinib-Therapie) gehört der Nachweis einer ALK-Aktivierung beim fortgeschrittenen, nicht rein plattenepithelialen NSCLC zum diagnostischen Standard [1] [2] [3] [4]. Die in den Zulassungsstudien verwendete Nachweismethode von ALK-Inversionen/Translokationen stellte die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) dar und gilt bis dato als Goldstandard [5] [6]. Dies spiegelt sich auch im FDA-Zulassungstext des Medikamentes wider. Die Medikamentengabe ist in den USA an den Nachweis durch einen spezifischen ALK-FISH Test von Abbott („companion diagnostic test“) gekoppelt [7]. Auf europäischer Ebene (EMA-Zulassung) wird hingegen (lediglich) der Nachweis eines „fortgeschrittenen ALK-positiven NSCLCs“ verlangt [8]. Dies ermöglicht methodische Flexibilität, birgt somit aber Chance und Risiko zugleich. So zeigte der Nachweis des ALK-Proteins mittels Immunhistochemie (IHC) zu Beginn Erfolg versprechende Ansätze (monozentrisch) [9], die sich allerdings zunächst nicht problemlos in die Breite (multizentrisch) übertragen ließen (falsch positive oder negative Ergebnisse) [10]. Ursächlich hierfür ist das relativ breite Spektrum an verfügbaren (und auch zur Anwendung kommenden) Antikörpern diverser Anbieter (unterschiedliche Klone, Verdünnungen, Detektionssysteme und Färbeverfahren). Die in der Zwischenzeit durchgeführten multizentrischen Studien (Methodenvalidierung) beschreiben zwei Klone, welche verlässliche Ergebnisse liefern und somit auch für den diagnostischen Alltag empfohlen werden können [11] [12].

Im Rahmen der European Thoracic Oncology Platform (ETOP) wurde der 5A4-Klon (Novocastra) validiert [11]. Die Auswertung erfolgt mittels IHC-Score (0 – 3). Mit diesem Ansatz konnte eine gute Vorauswahl ALK-positiver Tumoren getroffen werden. Von 1281 Fällen waren 80 positiv (48× IHC1+; 10× IHC2+; 22× IHC3+), bei 28 Fällen (28/80: 35 %) konnte eine ALK-Alteration mittels FISH bestätigt werden. Die Übereinstimmung von IHC und FISH lag bei Score 1 bei 4,2 %, bei Score 2 bei 60,0 % und bei Score 3 bei 90,9 %. Es erscheint notwendig, bei Score 1 und 2 immer eine FISH anzuschließen (Sicherung der Diagnostik), wohingegen eine starke Proteinexpression (Score 3) durchaus als hinreichend aussagekräftig und therapierelevant interpretiert werden kann, auch wenn in der beschriebenen Studie bei zwei Fällen mit maximaler ALK-Expression keine Alteration mittels FISH detektiert werden konnte (möglicherweise falsch negatives FISH-Ergebnis, weitere Erläuterung siehe unten).

Den zweiten im Rahmen der Europäischen Harmonisierungsstudie validierten Ansatz stellt das D5F3-Optiview System (Ventana) dar [12]. Der Antikörper wurde an 40 ALK-FISH-positiven Fällen validiert [13]; an 103 Fällen wurde ein entsprechender Interpretationsalgorithmus (sehr gute Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Auswertern) untersucht [14] und abschließend der verlässliche multizentrische Einsatz nachgewiesen [12]. Der wesentliche Unterschied zu dem oben genannten Ansatz beim 5A4-Klon besteht in der binären Auswertung (d. h. negativ oder positiv, kein Score). Trotz des vermeintlich einfacheren Auswerteschemas wurden aber auch hier vereinzelt heterogene (schwache) Färbemuster beobachtet (teils biologisch, teils bedingt durch das spezifische Verstärkersystem), welche eine weiterführende Translokationsanalyse (z. B. FISH) erforderlich machten [12].

Viele weitere, teils vergleichende Arbeiten konnten den verlässlichen Einsatz beider Klone bestätigen [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21]. Eine sehr lesenswerte Übersicht publizierten Hutarew u. Mitarb. [20]. Ein ebenfalls vielversprechender, noch nicht multizentrisch validierter Antikörper, der künftig an Bedeutung gewinnen könnte, ist der 1A4-Klon (Origene, Rockville), welcher in ersten Untersuchungen vergleichbare Ergebnisse zum D5F3-Optiview System lieferte [22].

Die ALK-IHC kann somit verlässlich in der Diagnostik eingesetzt werden. Allerdings muss festgehalten werden, dass bei Kombination von IHC und Translokationsanalysen gelegentlich diskrepante Ergebnisse beobachtet werden (siehe [Tab. 1], [Abb. 1]).

Tab. 1 Mögliche Ergebnisprofile bei eingesetzter validierter ALK-IHC und FISH und ihre Bedeutung (IHC: Immunhistochemie; FISH: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung).

ALK-Ergebnis	Bewertung/Interpretation
IHC−/FISH−	ALK-negativ
IHC−/FISH+ (FISH borderline)	gute Datenlage [15] [16] [17] [18] [19] [20] [22] [26] [27] [29] technisches FISH-Artefakt ALK-negativ
IHC+/FISH− (FISH borderline)	gute Datenlage [10] [23] [24] [25] [26] [27] [28] technisches FISH-Artefakt ALK-positiv
IHC+/FISH+	ALK-positiv
IHC−/FISH+	schlechte Datenlage [17] [18] [30] [31] klinisch korrelierte NGS-Ergebnisse ausstehend Fall-Kontroll-Studien fehlen
IHC+/FISH nicht auswertbar (materialbedingt)	ALK-positiv

Bei eindeutiger IHC (−: klar negativ; +: klar positiv) kann ein sogenanntes FISH-borderline-Ergebnis vernachlässigt werden und die Klassifikation auf Basis der IHC erfolgen. Es erscheint praktikabel, eine eindeutig positive ALK-IHC als ausreichend für die Therapieentscheidung heranzuziehen. Unklar ist, ob IHC-negative Fälle mit eindeutig positiver ALK-FISH-Alteration (nicht im Graubereich) überhaupt von einer Therapie profitieren.

Abb. 1 Interpretationsalgorithmus der ALK-Testung in Abhängigkeit der Methodik (IHC: Immunhistochemie; FISH: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) und des IHC-Klons (D5F3, 5A4).
Bei fraglicher ALK-Expression (D5F3) sollte eine ALK-FISH durchgeführt werden und die Gesamtbewertung in Abhängigkeit dieser erfolgen. Fraglich positive Tumoren können mit diesem IHC-Ansatz einerseits im Rahmen eines heterogenen (jedoch biologischen) Färbemusters entstehen, die konsekutive ALK-FISH ist dann positiv, andererseits kann in einzelnen Fällen ein nicht-tumortypisches Färbemuster („stippled staining pattern“) vorliegen, welches sich durch das IHC-Verstärkerssystem erklärt und keine biologische Positivität darstellt, diese Fälle können/sollten bei Unklarheit zur Absicherung mittels ALK-FISH untersucht werden (das Ergebnis ist negativ). Da die biologische Wertigkeit einer ALK-Expression (5A4) bei Score 1 und 2 aktuell unklar ist, sollten neben der ALK-FISH ggf. weitere Untersuchungen sowie klinische Daten für eine abschließende Bewertung herangezogen werden.
Bemerkung zur FISH-Auswertung: Laut Hersteller sollen 50 Tumorzellen ausgewertet werden, in dann unklaren Fällen (d. h. ALK-positive Muster in 5 – 25 der Tumorzellen, entsprechend 10 – 50 %) sollen nochmals 50 Tumorzellen von einer zweiten Person ausgewertet werden. Ein Fall gilt als ALK-positiv, wenn die Summe beider Auswertungen mindestens 15 % alterierte Signale aufweist (siehe http://www.abbottmolecular.com/static/cms_workspace/pdfs/US/Vysis_ALK_FISH_Probe_Kit_PI.pdf). Da die meisten Studien sich auf den 15 %-Cut-off beziehen, findet dieser in der obigen Abbildung Verwendung.
*Bei Einsatz der beiden IHC-Ansätze sollte jeweils das in den Validierungsstudien beschriebene Protokoll bezüglich Verdünnung, Detektions- und Verstärkersystem verwendet werden [siehe auch Literatur [11] [12] [13]. Es sei darauf verwiesen, dass die ETOP-Gruppe hier auch die Möglichkeiten eines manuellen Färbeansatzes beschreibt.

So konnten Fallberichte bzw. kleinere Fallserien die ALK-Alteration bei entsprechenden IHC+/FISH−-Tumoren mittels RT-PCR oder Next Generation Sequencing (NGS) bestätigen und das Ansprechen auf ALK-Inhibitoren dokumentieren [23] [24] [25]. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass derartige Fälle aufgrund technischer (zumeist nicht biologischer) Gegebenheiten, nicht verlässlich mittels FISH detektiert werden können, da die Anzahl der positiven ALK-Signale in einem sogenannten Graubereich (um den Cut-off von 15 %) liegt [10] [26] [27]. Insbesondere im Rahmen der bioptischen Diagnostik (wenige Tumorzellen) wird diese Konstellation eher beobachtet; hier sollte ein etwaiges eindeutiges Ergebnis einer validierten IHC für die Therapieplanung herangezogen werden [28].

Problematischer hinsichtlich der therapeutischen Konsequenz können hingegen Tumoren mit ALK-IHC−/FISH+-Profil sein. Ähnlich wie bei den oben beschriebenen IHC+/FISH−-Tumoren handelt es sich hierbei jedoch zumeist um Fälle, deren FISH-Ergebnis im Bereich der Cut-offs liegt (z. B. wenige Prozentpunkte oberhalb) [15] [16] [17] [18] [19] [20] [22] [26] [27] [29]. Die Überlegung, dass es sich hier um Fälle mit unklarer biologischer Wertigkeit handelt (falsch positive FISH?), unterstreicht die Arbeit von Ilie u. Mitarb. Diese beschreiben 5 Patienten mit knapp über dem Cut-off liegenden ALK-FISH-positiven Tumoren; alle Tumoren wiesen mittels validierter IHC (D5F3-Optiview) keine Expression des entsprechenden Proteins auf [15] [16]. Lediglich drei dieser Fälle sprachen (unterschiedlich gut) auf Crizotinib an, diese drei zeigten interessanterweise eine zusätzliche MET-Überexpression. Die MET-Überexpression bietet in diesem Kontext eine mögliche Erklärung für den ALK-unabhängigen Therapieerfolg des ursprünglich als MET-Inhibitor entwickelten Crizotinibs. Zu vergleichbaren Schlussfolgerungen kommen weitere Arbeiten [17] [18], die über falsch positive FISH-Ergebnisse bei negativer IHC (5A4 Novocastra, D5F3-Optiview Ventana) mit Raten von 13,8 % (4/29) und 13,3 % (2/15) berichten, abrundend dokumentiert durch einen Patienten mit „borderline“-positiver ALK-FISH (18 % alterierte Signale), negativer IHC und ohne Therapieansprechen [17]. Demgegenüber beschreiben Cabillic u. Mitarb. [29], dass circa 25 % aller ALK-positiven Fälle nicht erkannt werden würden, falls man sich in der Diagnostik lediglich auf eine der beiden Methoden stützen würde. In dieser Arbeit wurde jedoch keiner der oben beschriebenen validierten IHC-Ansätze verwendet, sodass die Arbeit keine Schlussfolgerungen in Bezug auf die diagnostische Praxis erlaubt und daher nicht entsprechend interpretiert werden sollte.

Aktuell noch schwierig zu beantworten ist die Frage, wie mit den sehr seltenen Fällen umgegangen werden muss, die ein eindeutig positives FISH-Ergebnis (also deutlich oberhalb des Cut-offs) und eine negative IHC aufweisen. Hier gibt es bisher keine entsprechende klinische Datenlage, auch wenn erste Arbeiten davon ausgehen, dass möglicherweise keine Transkription oder Translation des ALK-Fusionsgens stattfindet [30] [31] [32]. Zukünftige, NGS-basierte, klinische Fallbeobachtungsstudien können helfen, ein diesbezügliches Statement zu formulieren [25] [32] [33].

Insgesamt scheinen die berichteten IHC−/FISH+-Tumoren in Bezug auf den FISH Cut-off überwiegend grenzwertige Fälle darzustellen, bei denen die ALK-Expression zumindest nicht belegt werden kann. Zwar ist es bei alleiniger Anwendung der FISH im Sinne der Zulassungskriterien formal korrekt, diese Fälle als positiv zu werten, es empfiehlt sich jedoch, insbesondere aufgrund der oben beschriebenen klinischen Daten, im Grenzbereich der FISH-Positivität von 10 – 20 % [27] eine zusätzliche validierte ALK- (und ggf. MET-) IHC durchzuführen ([Abb. 1]), insbesondere wenn valide therapeutische Alternativen zur ALK-Inhibitor-Therapie bestehen. Umgekehrt spricht die Summe der bisherigen Ergebnisse nicht gegen einen validierten immunhistologischen Ansatz, da der therapeutische Erfolg bei eventuell „verpassten“, grenzwertig FISH-positiven Fällen zumindest fraglich erscheint. Weitere Untersuchungen dieses grenzwertigen Kollektivs sind erforderlich, um eine eventuelle Anpassung des Cut-offs zu prüfen [25] [32] [33].

Die Datenlage hinsichtlich der fraglich positiven ALK-Expression (Score 1 und 2 beim 5A4-Ansatz) und ihrer biologischen Wertigkeit bleibt zunächst unklar [11] [34] [35]. Ein Teil dieser Fälle (insbesondere Score 2) scheint eine biologische Realität darzustellen. Eine ALK-FISH-Untersuchung ist in diesen Fällen jedoch unerlässlich; es empfiehlt sich ggf. eine weitere Validierung mit NGS-Analysen an dafür spezialisierten Zentren [32] [33], insbesondere falls das FISH-Ergebnis ebenfalls nicht eindeutig sein sollte.

Zusammenfassung

Die vorliegenden Ergebnisse etablieren die Immunhistologie als valides diagnostisches Verfahren zur Bestimmung des ALK-Status. Weitere qualitätssichernde Maßnahmen sollten die praktische Anwendung begleiten. Zukünftige Ringversuche im Rahmen der QuiP (Qualitätssicherungs-Initiative Pathologie), die die diagnostische Verlässlichkeit in der Breite sicherstellen, werden neben der validierten IHC und FISH auch die Wertigkeit des NGS prüfen müssen.

Zusammenfassend ergibt sich aufgrund der bisherigen Studienlage folgende Stellungnahme ([Abb. 1]):

• Mit den ALK-Inhibitoren Crizotinib und Ceritinib sind derzeit zwei ALK-Inhibitoren von der EMA zugelassen, deren Einsatz den Nachweis einer ALK-Aktivierung im Tumorgewebe erfordern. Für den diagnostischen Nachweis stehen als validierte Nachweisverfahren FISH und IHC (in einzelnen Zentren zusätzlich NGS-basierte Verfahren) zur Verfügung. Gemäß EMA-Zulassungstext stellt die ALK-IHC ein der FISH zumindest gleichwertiges Nachweisverfahren dar.

• Für die diagnostische ALK-IHC stehen derzeit zwei validierte Antikörper (5A4 und D5F3) zur Verfügung, die gemäß der oben beschrieben Validierungsstudien (Verdünnung, Detektions- und Verstärkersystem) eingesetzt werden können und ein differenziertes Vorgehen erfordern.

• Bei Einsatz des D5F3-Antikörpers (Optiview, Ventana) ist es vertretbar, zweifelsfrei positive Fälle auch ohne weitere FISH-Analytik als ALK-positiv zu berichten und hiermit eine ALK-Inhibitor-Therapie zu ermöglichen. Bei fraglichen Fällen sollte eine FISH-Analytik angeschlossen werden und der Fall nur bei FISH-Positivität (≥ 15 %) als ALK-positiv berichtet werden.

• Bei Einsatz des 5A4-Antikörpers (Novocastra) scheint es gerechtfertigt, 3+Fälle auch ohne weitere FISH-Analytik als ALK-positiv zu berichten. Bei einem IHC-Score von 2+ und 1+ sollte eine FISH-Analytik nachgeschaltet werden; nur im Falle eines dann positiven FISH-Ergebnisses ist es derzeit vertretbar, den Fall als ALK-positiv zu bezeichnen. Es ist allerdings aktuell unklar, ob z. B. Patienten mit IHC2+/FISH−-Tumoren von einer Therapie profitieren könnten. Somit sollten bei der Bewertung derartiger Fälle insbesondere auch klinische Überlegungen (z. B. Alter, Raucherstatus) und weitere Testergebnisse (z. B. MET-IHC, NGS) berücksichtigt werden.

• Erfolgt die ALK-Testung primär als FISH-Untersuchung, empfiehlt es sich, im Grenzbereich des Cut-offs (15 %; +/− 5 %) eine zusätzlich ALK-Immunhistologie durchzuführen (ggf. auch zusätzliche Durchführung einer MET-IHC oder NGS), um das Ergebnis abzusichern. Es bleibt jedoch festzuhalten, dass alle Fälle mit einer FISH-Positivität formal korrekt als ALK-positiv berichtet sind.

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