Kupfer ist ein essentielles Spurenelement. Störungen des Kupferhaushaltes durch Überladung
oder Defizit, wie es bei der Wilson (WD) und Menke Krankheit auftritt, sind lebensbedrohlich.
Dem WD liegt ein Funktionsverlust der ATPase 7B zugrunde, welches vorrangig in der
Leber exprimiert wird. Die Kenntnis über alle beteiligten molekularen Mechanismen
an der Kupferpathophysiologie ist grundlegend für die Verbesserung von therapeutischen
Optionen.
Das Ziel des Projektes war die Identifizierung unbekannter Kupfertransporter in einer
Hepatomazelllinie.
Für die Untersuchungen wurde eine humane Hepatomazelllinie (HepG2) ohne funktionelles
ATP7B (KO), sowie zwei Varianten von kupferresistenten KO Zelllinien (CpR, CuR) verwendet.
Es wurde die Lebensfähigkeit (MTT) und die intrazelluläre Kupfer (Cu) Akkumulation
(AAS) nach Kupferexposition untersucht. RT-qPCR Analyse, sowie Überexpression und
siRNA vermittelter Knockdown wurden zur Detektion und Validation von Transporterkandidaten
eingesetzt.
Die Kupferresistenz der beiden KO Varianten CuR und CpR wurde im MTT Test bestätigt.
Eine Genexpressionsanalyse beider Zelllinien, CpR und CuR, zeigte eine Runterregulation
des Organic cation transporter 3 (CpR 5,17 ± 2, CuR -3,3 ± 0,4). Durch die Behandlung
von naiven Zellen mit einer gegen OCT3 gerichteten siRNA konnte eine Erhöhung der
Überlebensfähigkeit nach Kupferexposition um 21% detektiert werden. Eine Behandlung
der CpR Zellen mit einem OCT3 Expressionsvektor führte hingegen zu einem Verlust der
Kupferresistenz. Im Weiteren zeigte die Analyse des intrazellulären Kupfergehaltes
nach OCT3-siRNA Behandlung eine Reduktion um 33,2% im Vergleich zur naiven Zelle.
Unsere Untersuchungen an kupferresistenten und naiven Hepatomazellen, legen eine Beteiligung
von OCT3 am hepatischen Kupfermetabolismus nahe. Diese bislang unbekannte Transportfunktion
des OCT3 erweitert das Verständnis der molekularen Vorgänge in der Pathogenese der
Wilson Krankheit.
