Schlüsselwörter
Big data - Genetik, Genomik -
GJB2
- Hochdurchsatz-Sequenzierung - Genetik - Schwerhörigkeitsdiagnostik - Varianteninterpretation
Abkürzungsverzeichnis
A:
Adenin
C:
Cytosin
CADD:
engl. Combined Annotation Dependent Depletion
CCIC:
engl. Comprehensive Cochlear Implant Center
CNV
:
engl. copy number variation
COL11A2
:
engl. collagen type XI, alpha-2
ddNTP:
Didesoxynukleotidtriphosphat
DFNA2A:
engl. deafness, autosomal dominant 2 A
DFNA3A:
engl. deafness, autosomal dominant 3 A
DFNA6/14/38:
engl. deafness, autosomal dominant 6/14/38
DFNA13:
engl. deafness, autosomal dominant 13
DFNB1A:
engl. deafness, autosomal recessive 1 A
DFNB16: engl. deafness, autosomal recessive 16
dNTP:
Desoxynukleotid
DVD:
engl. Deafness Variation Database
E:
Embryonales Entwicklungsstadium
EVS:
engl. Exome Variant Server
ExAC:
engl. Exome Aggregation Consortium Browser
G:
Guanin
Gb:
Gigabase
GJB2
:
engl. gap junction protein beta 2
GJB6
:
engl. gap junction protein beta 6
GME:
engl. Greater Middle Eastern Variome
gnomAD:
engl. genome aggregation database
HGMD:
engl. Human Gene Mutation Database
HGP:
engl. Human Genome Project
HPO:
engl. Human Phenotype Ontology
KCNQ4
:
engl. Potassium voltage-gated channel subfamily KQT member 4
LOVD:
engl. Leiden Open Variation Database
MAF:
engl. minor allele frequency
NIH:
engl. National Institutes of Health
mRNA:
engl. messenger ribonucleic acid
MYO1A
:
engl. myosin IA
P:
Postnatales Entwicklungsstadium
PCR:
Polymerase-Kettenreaktion
SHIELD:
engl. Shared Harvard Inner-Ear Laboratory Database
SIFT:
engl. Sorting Intolerant from Tolerant
STRC
:
engl. stereocilin
T:
Thymin
WFS1
:
engl. wolframin ER transmembrane glycoprotein
1. Glossar
Abdeckung Die Sammlung von ausgerichteten Sequenzierungslesungen (engl. read) über einem Nukleotid
oder einem Zielbereich.
Ablesungen Ein kurzes Fragment der Sequenz (engl. Reads).
Autosom Chromosom, das nicht zu den Gonosomen (Geschlechtschromosomen) gehören.
Baits „Köder“, Capture-Sonden, die aus Oligonukleotiden bestehen, die zu einer Zielregion
für die Sequenzierung komplementär sind.
CFTR Ein Gen, das für einen Chloridkanal kodiert und an der autosomal rezessiven Mukoviszidose
beteiligt ist.
Desoxynukleotid Modifiziertes Desoxynukleotid, dem eine 3´ Hydroxylgruppe fehlt, um die DNA-Kettenverlängung
bei der Sanger-Sequenzierung zu hemmen.
DNA-Bibliothek Eine Sammlung von amplifizierten DNA-Fragmenten für die Hochdurchsatz-Sequenzierung.
Exom Der Teil des Genoms, der potentiell für Proteine kodiert.
Exomsequenzierung Sequenzierung aller Exons in kodierenden Genen.
Exon Eine Region eines Gens, das für ein Protein kodiert.
Genom Der komplette DNA-Satz in einem Organismus.
Gigabase 109 Nukleotide.
GJB2
Ein Gen, das für das gap-junction-beta-2 (Connexin-26) kodiert, das einen autosomal-rezessiven
(DFNB1A) und autosomal-dominanten (DFNB3A) Hörverlust verursacht.
Hochdurchsatz-Sequenzierung Ein skalierbares und relativ kostengünstiges Sequenzierungsverfahren, das von Gen-Panels
bis zur kompletten Genomsequenzierung reichen kann.
Indel Ein Begriff für die Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Basen in einem Genom.
In silico Paneldiagnostik Ein Berechnungsfilter, der auf Exom- oder Genomsequenzierungsdaten angewendet wird,
der die Varianten für die Analyse in einer ausgewählten Teilmenge von Genen einschränkt.
In silico Vorhersageprogramme Computerwerkzeuge, die die Pathogenität von Varianten vorhersagen.
Intron Eine nicht kodierende Region eines Gens zwischen zwei kodierenden Exons.
Kilobase 1,000 Nukleotide.
Kopienzahl-Variation Deletionen oder Duplikationen von chromosomalen Regionen, die die Anzahl der Genkopien
beeinflussen.
Lücken Eine Region, die während der Sequenzierung meist aus technischen Gründen schlecht
abgedeckt oder übersehen wird.
Megabase 1,000,000 Nukleotide.
missense-Veränderung Eine Nukleotidsubstitution, die eine Aminosäure verändert.
Mooresches Gesetz Eine Beobachtung, dass sich die Anzahl der Transistoren auf einer dichten integrierten
Schaltung alle 2 Jahre verdoppelt und damit die Kosten für Transistoren halbiert werden.
nicht-synonyme Veränderung Eine Nukleotidsubstitution, die die Aminosäuresequenz verändert.
Niedrige Allelfrequenz Die Häufigkeit des weniger verbreiteten Allels.
nonsense-Veränderung Nukleotidsubstitution, die zu einem vorzeitigen Stoppcodon während der Transkription
führt.
Panel-Diagnostik Sequenzierung ausgewählter Gene, die für eine bestimmte Krankheit relevant sind.
Phänome Die umfassende Beschreibung des Phänotyps und des Krankheitsverlauf in einem Individuum.
Sanger-Sequenzierung Eine Art der Sequenzierung, die ein Kettenverlängerungsabbruch mit chemisch modifizierten
Dideoxynukleotiden verwendet. Mit dem Verfahren wird eine DNA-Sequenzierung ermöglicht.
Spleiß-Veränderung Eine Variante, die das normale Gen-Spleißen während der Übersetzung beeinflusst.
Start gain variant Eine Variante, die eine neue Übersetzungsinitiierungsstelle verursacht.
Start loss variant Eine Variante, die die normale Übersetzungsinitiierungsstelle stört.
Stop gain variant Eine Variante, die zu einem vorzeitigen Stoppcodon während der Transkription führt.
Stop loss variant Eine Variante, die das Terminator-Codon entfernt und zu einem verlängerten Transkript
führt.
STRCEin Gen, das für Stereocilin kodiert, ein Strukturprotein in der Stereozilien der
äußeren Haarzellen des Innenohrs, das einen autosomal-rezessiven Hörverlust verursacht
(DFNB16).
synonyme Veränderung Nukleotidsubstitution, die die Aminosäuresequenz nicht verändert.
Terabase 1012 Nukleotide.
Variante Eine Abweichung von der Referenzsequenz.
Zusatzbefund Ein genetisches Testergebnis, das nichts mit der primären Krankheitsindikation zu
tun hat.
2. Big data im Zeitalter der Genomik
2. Big data im Zeitalter der Genomik
„Big data“ ist mittlerweile ein allgegenwärtiger Begriff im Gesundheitswesen. Für
die Bereiche Genetik und Genomik ist diese „große Datenrevolution“ geradezu tragend.
Es erscheint mittlerweile unmöglich, aussagekräftige Ergebnisse zu gewinnen und diese
zu interpretieren, ohne auf die großen Datenmengen – „big data“ – der in zahlreichen
Datenbanken gespeicherten genomischen Informationen zuzugreifen. Das grundlegendste
Beispiel für „big data“ in diesem Bereich ist die menschliche Genomsequenz, die im
einfachsten Sinne als Blaupause für die Aufklärung der DNA-Sequenz der mehr als 20 000
Gene im menschlichen Genom dient. Im Jahr 2003 wurde die vollständige Sequenzierung
des menschlichen Genoms im Rahmen des Humangenomprojekt (engl.: Human Genome Project; HGP) offiziell erreicht. Die Vollendung des HGP stellt einen
bemerkenswerten Meilenstein dar, der das Verständnis der genetischen Variation im
menschlichen Genom überhaupt erst umfassend ermöglicht und weiter beschleunigt hat.
Diese enorme internationale Forschungsanstrengung hatte neben den beiden im Vordergrund
stehenden Zielen alle Gene des Menschen zu identifizieren und die gesamte Sequenz
der 3,2 Milliarden Basenpaare der DNA des Menschen zu analysieren auch technologische
Aufgaben – nämlich relevante Technologien für die Sequenzierung und Datenanalyse zu
finden. Dies führte mit einer gewissen zeitlichen Verzögerung etwa ab dem Jahr 2006
zu einer sich eher im Hintergrund vollziehenden, technologischen Revolution insbesondere
im Bereich der Sequenzier-Technologien. In Folge konnte von der generischen Analyse
des humanen Genoms auf die Analyse einer hohen Anzahl individueller Einzelgenome und
funktioneller Element übergegangen werden. Aus dem HGP entwickelten sich daher in
Folge weitere Projekte. Seit 2003 verfolgt das Projekt ENCODE (ENC ncyclopedia O f D NA E lements) des National Institutes of Health (NIH) das Ziel, die funktionalen Elemente
des menschlichen Genoms zu identifizieren und deren Rolle für die Genregulation zu
beschreiben. Das im Jahr 2006 initiierte Projekt PGP (P ersonal G enome P roject) möchte allen Menschen den Zugang zu ihrem Genom verschaffen, um damit eine
individualisierte medizinische Behandlung zu ermöglichen. Zunächst sind mindestens
100 000 Teilnehmer vorgesehen. Im Rahmen des Projekts 1000-Genomes konnte bereits
im Jahr 2012 ein Katalog genetischer Varianten von mehr als 1000 Personen aus weltweit
14 verschiedenen Populationen veröffentlicht werden. Im Jahr 2015 erfolgte eine Erweiterung
auf 2504 Personen. Im dem seit 2008 aktiven, spezifisch auf Krebserkrankungen ausgerichteten
Internationalen Krebsgenom-Konsortium (I nternational C ancer G enome C onsortium; ICGC, http://icgc.org) sollen 50 Tumorarten von 25 000 Patienten umfassend molekular analysiert werden.
Alle diese Datenbanken tragen ständig neue „big data“ Bausteine bei und verbessern
fortlaufend unser Verständnis der normalen und der krankheitsassoziierten genetischen
Vielfalt.
Die Variationen im menschlichen Genom tragen nicht nur zu unseren einzigartigen Eigenschaften
bei, sondern bestimmen häufig auch die Chancen für eine gezielte Behandlung im Krankheitsfall.
Das menschliche Genom ist das Ergebnis von Generationen von Migration, Selektion und
Anpassung. Natürlich auftretende Fehler während der Meiose können sowohl kleine als
auch große Veränderungen, die als genetische Variation bezeichnet werden, in unser
Genom einbringen. Hiervon können viele als gutartig oder polymorph angesehen werden,
während andere Veränderungen auslösend für Erkrankungen und damit pathogen sein können.
Diese Veränderungen können einzelne Nukleotide, auch als Basen bezeichnet (Adenin
(A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C)), oder mehrere Millionen Nukleotide im
Genom betreffen. Veränderungen können aber auch ganze Chromosomen (z. B. Monosomie,
Trisomie) einbeziehen oder den Austausch von genetischem Material innerhalb verschiedener
Teile eines einzelnen Chromosoms (intrachromosomale Rekombination) oder zwischen verschiedenen
Chromosomen (interchromosomale Rekombination) beschreiben.
2.1 Genetische Variation – gutartig oder pathogen?
Das Exome Aggregation Consortium (ExAC) hat die Exomsequenzen (Protein-kodierende
Sequenz) von 60 706 Individuen zusammengetragen und stellt diese Daten über eine Internet-basierte
Plattform insbesondere auch im Hinblick auf die Frequenz und funktionelle Bedeutung
von genetischen Varianten zur Verfügung. Aus dieser bisher größten Exom-basierten
Sequenzierstudie wird abgeschätzt, dass beim Menschen in der Protein-kodierenden Sequenz
das Äquivalent von einer Variante pro acht Nukleotidpositionen vorliegt [1]. Die Entschlüsselung von Variations-Mustern ist schwierig, da die Variation einer
ungleichmäßigen Verteilung folgt und die Dichte der Variation durch Mutationseigenschaften
und selektive Auswahl beeinflusst wird.
Eine weitere wichtige Form der genetischen Variation ist die Kopienzahl-Variation
(engl.: Copy Number Variation; CNV). Die CNVs sind definiert als Duplikationen und Deletionen
eines DNA-Abschnitts mit 50 bis zu 3 000 000 Basenpaaren. Auf Basis dieser Art der
genetischen Variation können bis zu 9,5% des Genoms bei gesunden Menschen variieren
und an „Gewinnen“ (Genduplikationen) oder „Verlusten“ (Gendeletionen) beteiligt sein
[2]. Folglich können die 3,2 Milliarden Nukleotide, die sich normalerweise in unserem
Genom befinden, um±9,5% variieren. Dies zeigt eindrucksvoll die Widerstandsfähigkeit
des menschlichen Genoms auch gegenüber z. T. großen Veränderungen.
Eine der grundlegenden Aufgaben der klinischen Interpretation genomischer Daten ist
die Differenzierung zwischen normaler und pathogener Variation [3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]. In den letzten 15 Jahren seit der Entschlüsselung der menschlichen Genomsequenz
hat die Genomforschung damit begonnen, Toleranz und Intoleranz für Variation näher
zu charakterisieren. Hierfür werden bei gesunden und erkrankten Individuen die Veränderungen
der Gene verglichen, die bei Erkrankungen wiederholt betroffen sind. Da sich das Wissen
auf Basis der immer schnelleren und präziseren Sequenziertechnologien in hoher Geschwindigkeit
weiterentwickelt besteht in diesem Gebiet eine erhebliche Entwicklungsdynamik.
3. Wegbereiter für die Genomik-Revolution
3. Wegbereiter für die Genomik-Revolution
Der Weg zum menschlichen Genom ([Abb. 1]) hat seine Wurzeln auch an Universität Tübingen. Der aus einer bekannten Medizinerfamilie
stammende Arzt Friedrich Miescher entdeckte und isolierte hier im Jahr 1869 das Nuklein
([Abb. 2]) aus den Kernen von weißen Blutkörperchen [10]. Miescher hatte nach seinem Medizinstudium in Basel zunächst vor eine klinische
Ausbildung zu durchlaufen, dann aber aufgrund der seit seiner Kindheit bestehenden
Schwerhörigkeit bewusst auf eine klinische Tätigkeit verzichtet und sich der Forschung
in Tübingen zugewandt [10]. Obwohl Miescher die Bedeutung seiner Entdeckung nicht vollständig erkannte, vermutete
er dennoch, dass die Substanz, die er isoliert hatte, die Moleküle der Vererbung darstellen.
Dies wurde 75 Jahre später, im Jahr 1944, durch die klassischen Experimente von Avery,
MacLeod und McCarty bestätigt [11]
[12]. Im Jahr 1953 wurde die Struktur der DNA durch Watson und Crick aufgeklärt, die
auf Daten von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins aufbauten. Hierdurch entstand
das Gebiet der Molekularbiologie [13]
[14]. Mehr als zwei Jahrzehnte nach der Entdeckung der Struktur der DNA entstanden die
ersten beiden „zuverlässigen“ Sequenzierungsmethoden. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung
[15] basiert auf chemischer Spaltung. Diese Technik verwendet eine radioaktiven Markierung
von DNA-Fragmenten, die an jedem der Nukleotide (Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin)
chemisch gespalten werden, um die Reihenfolge zu bestimmen [16]. Eine alternative Form der Sequenzierung wurde nach einem der Entwickler, Fredrick
Sanger, benannt (Sanger-Sequenzierung) und basiert auf veränderten Ribosezuckern ([Abb. 3a]) [17]. Diese Methode wird auch als „chain-termination“ oder „Di-deoxy-Technik“ bezeichnet,
weil sie Dideoxynukleotide (ddNTPs) verwendet, denen eine 3'-Hydroxylgruppe fehlt,
wodurch die Verlängerung einer wachsenden Nukleotidkette gestoppt wird. Unter Verwendung
von 4 verschiedenen dNTP/ddNTP-Mischungen, von denen jede einem Nukleotid entspricht,
integriert die DNA sowohl normale dNTPs, die eine Verlängerung des DNA-Strangs ermöglichen,
als auch ddNTPs, die zu einem zufälligen Abbruch des DNA-Strangs führen ([Abb. 3b]). Die Sequenzfragmente werden auf ein Gel aufgetragen und die Nukleotidabfolge kann
bestimmt werden. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierungsmethode war jahrzehntelang weit verbreitet,
weil sie direkt DNA-Fragmente analysierte, während die frühen Methoden der Sanger-Sequenzierung
eine klonale Amplifikation eines DNA-Fragments erforderten. Nach weiteren Entwicklungen
übertraf jedoch die Popularität der Sanger-Sequenzierung die der Maxam-Gilbert-Sequenzierung,
sodass sie über ein Vierteljahrhundert die am häufigsten genutzte Sequenziermethode
darstellte und auch heute noch wegen ihrer Zuverlässigkeit in der Validierung weit
verbreitet ist.
Abb. 1 Die DNA-Revolution. Zeitleiste ausgewählter Meilensteine aus denen die moderne Molekulargenetik
hervorgegangen ist. Der Beginn datiert das Jahr 1869 mit der Entdeckung des Nukleins
durch den schwerhörigen Mediziner Friedrich Miescher in Tübingen.
Abb. 2 Friedrich Miescher und die Entdeckung der Nukleinsäuren. a Friedrich Miescher (geboren am 13. August 1844, gestorben am 26. August 1895) war
ein Schweizer Mediziner. Nach seinem Medizinstudium suchte Miescher wegen seiner Schwerhörigkeit
nach einem Fach ohne Patienten-Interaktion. Er beschloss daher, seine Karriere der
medizinischen Forschung zu widmen und ging aus diesem Grund nach Tübingen zu Felix
Hoppe-Seyler an die „Wiege der Biochemie“. Dort entdeckte er 1869 die Nukleinsäure,
den Grundstoff der Erbsubstanzen DNA und RNA. b Reagenzglas mit Nuklein aus Lachssperma, von Friedrich Miescher beschriftet und mit
seinem Namen versehen (um 1871). c Schlosslabor Tübingen „Wiege der Biochemie, in dem Felix Hoppe-Seyler das Hämoglobin,
und Friedrich Miescher die Nukleinsäure entdeckte. (Mit freundlicher Genehmigung des
Museums der Universität Tübingen; MUT)
Abb. 3 Sanger-Sequenzierung. Eine Darstellung der modifizierten modernen Sanger-Methode.
Ein Primer bindet an ein amplifiziertes Template und eine Erweiterung um ein einzelnes
Nukleotid erfolgt. Die Erweiterung mit Standard-Deoxynukleotiden (dATP, dGTP, dCTP,
ein dTTP, nicht dargestellt) erfolgt bis zur Integration eines fluoreszierend markierten
Dedeoxynukleotids (ddATP (orange), ddGTP (blau), ddCTP (grün), ddTTP (rot)), sodass
die wachsende DNA-Kette abbricht. Nach mehreren Zyklen werden die DNA Fragmente mit
einem Gel nach ihrer Länge getrennt und die Reihenfolge der Nukleotide entsprechend
der Sortierung der fluoreszenz-markierten Fragmente bestimmt.
Im Jahr 1985 wurde die Polymerase-Kettenreaktion (engl: p olymerase c hain r eaction; PCR) entwickelt. Hierbei wurden zwei Primer-Paare verwendet, die einen Abschnitt
der zu kopierenden DNA flankieren. Diese Idee spielte eine Vorreiterrolle in der modernen
Molekularbiologie [18]. Diese Methode war auch grundlegend für das Humangenomprojekt, das Ende der 80er
Jahre geplant und 1990 offiziell gestartet wurde [19]. In der damaligen westdeutschen Regierung gab es bezüglich der ethischen Fragen
starken Widerstand gegen dieses Projekt [20]. Dennoch war Deutschland eines von nur 6 Ländern, die gemeinsam fast die gesamte
Sequenzierung im Humangenomprojekt [21] durchführten.
Im Jahr 1994 wurde die erste Humangenomkarte mit 5 840 Loci veröffentlicht. Dies stellte
einen großen Fortschritt in der genetischen Kartierung dar und unterstützte die Bemühungen
zur Identifizierung von Genen erheblich [22]. Im folgenden Jahr wurde der erste Organismus, Haemophilus influenzae, [23] sequenziert, vier Jahre später folgte das menschliche Chromosom 22, das zweitkleinste
der Autosomen [24]. Das Genom von Drosophila melanogaster wurde im Jahr 2000 sequenziert [25] und ebnete den Weg für die Erforschung konservierter Gene, die für Erbkrankheiten
beim Menschen verantwortlich sind [26]. Die Komplettierung der menschlichen Genomsequenz im Jahr 2003 eröffnete nicht nur
eine neue Ära in der Medizin, sondern beförderte auch bedeutende Entwicklungen in
der DNA-Sequenzierung und den damit verbundenen Computertechnologien. Weniger als
2 Jahre später, im Jahr 2005, entstand die erste Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode
in der Gruppe von George Church [27], die einen neuartigen zyklischen Array- und Multiplex-Sequenzieransatz verwendete,
der die Kosten für die Sequenzierung auf etwa ein Neuntel der Kosten der Sanger-Sequenzierung
senkte. Diese transformative Methode wurde 2007 zur „Methode des Jahres“ gewählt [28].
4. Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien
4. Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien
Die Sequenzierung eines menschlichen Genoms dauerte im Humangenomprojekt fast 15 Jahre
und kostete $3 Milliarden USD. Heute kann diese Aufgabe in nur 19,5 Stunden für 1000
US $ [29]
[30] ausgeführt werden. Die DNA-Sequenziertechnologie existiert seit den 1970er Jahren
und hat sich zu einer unverzichtbaren Technologie in der molekulargenetischen Diagnostik
entwickelt. Die Sanger-Sequenzierung, die zur ersten Entschlüsselung des menschlichen
Genoms verwendet wurde, gilt aufgrund ihrer Zuverlässigkeit und Genauigkeit von bis
zu 99,999% [31] immer noch als „Goldstandard“ der Sequenzierung. Eine moderne Version dieser Sequenzierungsmethode
findet heute noch breite Anwendung [17]
[32]. Die Jahre unmittelbar nach der Entschlüsselung des menschlichen Genoms waren geprägt
von der Entwicklung kommerzieller Hochdurchsatz-Sequenziergeräte (Anmerkung: Die Begriffe
Hochdurchsatz-Sequenzierung, Next Generation Sequenzierung und massive parallele Sequenzierung
werden synonym verwendet) ([Abb. 4]). Diese Sequenziertechnologien haben die generierte Datenmenge um mehrere Größenordnungen
gesteigert. Diese Steigerung ermöglichte eine massive Kostenreduktion über einen relativ
kurzen Zeitraum ([Abb. 5]). Seit etwa 2007 hat die Reduktion der Sequenzierkosten sogar das Mooresche Gesetz
für die Reduktion von Rechenkosten deutlich übertroffen. Das Mooresche Gesetz besagt,
dass sich die Rechenleistung alle 2 Jahre verdoppelt und damit die Kosten halbiert
werden. Im Jahr 1998 erzeugte der Sequenzer ABI3730xl (Thermo Fisher Scientific) 84
Kilobasen Daten pro Lauf [21]. Mit dem 2005 vorgestellten Genome Analyzer (Illumina) System konnten 1,3 menschliche
Genome pro Jahr (Illumina) sequenziert werden, das waren 1 Gigabasen pro Lauf [33]. Dieser Technologiesprung wurde weiterentwickelt und brachte innerhalb von 10 Jahren
um das Jahr 2008 eine Verbesserung der Sequenzleistung von 102 Kilobasen pro Tag auf 1012 Kilobasen pro Tag [34]. Ein weiterer bemerkenswerter Fortschritt war im Jahr 2014 das HiSeqX Ten System
(Illumina), das 1,8 Gigabasen pro Sequenzierreaktion erzeugte und damit erstmals die
1000 US $-Grenze für ein menschliches Genom unterschritt. Das aktuelle NovaSeq 6000
System (Illumina) kann bis zu 6 Terabasen Sequenzdaten in weniger als zwei Tagen erzeugen.
Mit Blick auf die Zukunft scheint es sehr wahrscheinlich, dass sich diese Entwicklungen
für Sequenziergeschwindigkeit und Kostenreduktion fortsetzen werden. Das Sequenzierunternehmen
Illumina will das 100-Dollar-Genom in den nächsten 10 Jahren erreichen [35].
Abb. 4 Entwicklung der Sequenzierkosten über die vergangenen Jahrzehnte. Vergleich der Kosten
(in US$) und der generierten Datenmenge pro Jahr während der Weiterentwicklung der
Sequenziergeräte. Da die Gerätekapazität in Gigabasen (Gb) (Gb/Lauf, rot, rechte y-Achse)
zunahm, entsprach dies einem starken Rückgang der Sequenzierungskosten über die Zeit
(Kosten/Gb, blau, linke y-Achse). Die Kostenschätzung ist nur bis 2014 verfügbar.
Abb. 5 Darstellung der DNA-Sequenzierungskosten und dem Mooreschen Gesetz. Das Mooresche
Gesetz (engl.: „Moore’s law“) besagt, dass eine Kostenreduktion alle 2 Jahre durch
Verdoppelung der Rechenleistung integrierter Schaltkreisen in Rechenmaschinen erfolgt.
a Kosten pro Genom und b Kosten pro Megabase, von 2001 bis 2018 folgen einem nahezu identischen Profil. In
beiden Analysen liegt der Kostenrückgang seit 2007 deutlich über dem Mooreschen Gesetz.
Diese Sequenzierungstechnologien gingen mit anderen Entwicklungen in der Digitalisierung
wie der Datenspeicherung, dem parallelen Rechnen, der Weiterentwicklung der CPU-Architektur
und der Erfindung des World Wide Web einher. Dies hat ebenfalls zur Kostensenkung
beigetragen. Der sprunghafte Anstieg der Datenmenge und der starke Rückgang der Kosten
machen diese Methoden allgemein für den einzelnen Patienten zugänglich und ermöglichen
es der Forschung und klinischen Labors, große Datensätze von Hunderttausenden von
Personen zu generieren. Diese Datensätze sind entscheidend, um neue Zusammenhänge
bei Erkrankungen aufzudecken und die Annotation des gesamten Katalogs pathogener Varianten
des Menschen zu unterstützen. Die Umstellung auf „big data“ in der Erforschung des
Genoms hat enorme Auswirkungen auf die Diagnostik und auch die Behandlung von Patienten
in allen Krankheitsbereichen. Die Schwerhörigkeit ist aufgrund der zugrundeliegenden
genetischen Komplexität ein besonders interessantes und herausforderndes Beispiel.
5. Die Genetik des Hörverlustes
5. Die Genetik des Hörverlustes
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation treten genetische Störungen mit einer
Prävalenz von 10 pro 1000 Geburten auf [36] und betreffen lebenslang bis zu 1 von 17 Personen [37]. Schwerhörigkeit ist die häufigste kongenitale sensorische Störung, die ein bis
2 von 1000 Neugeborenen betrifft [38]. Mehr als die Hälfte der sensorischen Hörstörungen sind genetisch bedingt ([Abb. 6]). Ein Hörverlust tritt überwiegend nicht-syndromal (70%) auf, kann aber auch Teil
eines klinischen Syndroms (30%) sein [39]. Hörverlust wird klassischerweise nach dem Vererbungsmuster der Mendelschen Regeln,
autosomal-rezessiv (77%), autosomal-dominant (22%), X-chromosomal (1%) und mitochondrial
(<1%) vererbt [39]. Im Gegensatz zu manchen autosomal-rezessiven genetischen Störungen wie z. B. Mukoviszidose,
die durch pathogene Varianten in nur einem einzigen Gen (CFTR) diagnostiziert werden können, ist der erbliche Hörverlust eine genetisch stark heterogene
Erkrankung, an der mehrere hundert Gene beteiligt sind. Im Fall der Mukoviszidose
sind bis zu 70% der bei Patienten mit europäischer Ethnizität entdeckten Varianten
mit einer Deletion von 3 Basenpaaren verbunden, die für einen Verlust der Aminosäure
Phenylalanin (p.Phe508del) kodieren [40]. Im Gegensatz hierzu haben die Bemühungen, die molekulare Genetik des Hörverlusts
zu entschlüsseln, bereits zur Beschreibung von tausenden Varianten der derzeit bekannten
Gene für nicht-syndromale [41] und syndromale [42] Formen des Hörverlusts geführt ([Abb. 7a, b]). Die „Deafness Variation Database“ (DVD) hat mit einem Gen-Set von 152 Genen bereits
über 8 000 pathogene Varianten erfasst [42]. Zum Vergleich: Die Human Gene Mutation Database (HGMD) ist eine umfassende Sammlung
aller bekannter Keimbahnvarianten, die mit menschlichen Erkrankungen assoziiert sind.
Diese Datenbank (HGMD Professional 2018.2) enthält derzeit rund 225 000 Varianten,
von denen die überwiegende Mehrheit als pathogen klassifiziert ist [43]. Der relativ hohe Anteil an pathogenen Varianten allein für Hörverlust unterstreicht
die für diese Sinneserkrankung vorliegende genetische Komplexität.
Abb. 6 Anteil von Umweltfaktoren und genetischen Faktoren bei angeborenem Hörverlust. Etwa
bei der Hälfte der Patienten ist der Hörverlust auf eine genetische Ursache zurückzuführen.
Abb. 7 Anzahl der nicht-syndromalen und syndromalen Gene, die einen Hörverlust verursachen
(Hereditary Hearing Loss Homepage [41]). a Identifizierung der 175 Gene, die im Laufe der Zeit entdeckt wurden (schwarz), in
nicht-syndromale (orange) und syndromale (rot) Kategorien eingeteilt. b Betrachtung der Anzahl der Gene pro Jahr: nicht-syndromale Gene, die einen Hörverlust
verursachen (schwarz), aufgeteilt nach Vererbungsmuster, rezessiv (blau), dominant
(grau) und X-chromosomal (gelb), sowie mitochondriale Vererbung (grün). c Eine Übersicht über nicht-syndromale und syndromale Gene, die auf der „Hereditary
Hearing Loss Homepage“ dargestellt sind. Gene, die sowohl an autosomal-dominanten
und rezessiven als auch an nicht-syndromalen und syndromalen Hörverlust beteiligt
sind, werden jeweils einzeln in der jeweiligen Kategorie dargestellt. N ist die Anzahl
der identifizierten Gene.
Die „Hereditary Hearing Loss Homepage“ beschreibt derzeit 175 Gene für Hörverlust
([Abb. 7a]). Dazu gehören 161 nicht-syndromale Hörverlust-Loci, von denen 122 Gene identifiziert
wurden. Diese nicht-syndromalen Hörverlust-Gene wurden als ca. 70 autosomal-rezessive,
40 autosomal-dominante und 5 X -chromosomale Hörverlust-assoziierte Gene sowie 7 mitochondriale
Hörverlust-assoziierte Varianten klassifiziert. Weiterhin sind in dieser Datenbank
derzeit 53 Gene für syndromalen Hörverlust dokumentiert ([Abb. 7c]). Die genetische Heterogenität des Hörverlusts erschwert die Interpretation der
Befunde. Sowohl die hohe Anzahl der beteiligten Gene, als auch die hohe Anzahl pathogener
Varianten für jedes Gen tragen zu dieser Komplexität bei. Trotz dieser Komplexität
wurden erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung genetischer Schwerhörigkeit erzielt.
Dies ist der Entwicklung großer Datenbanken und Bioinformatik-Programme zu verdanken,
einschließlich jener, die speziell für die Genetik von Hörverlust entwickelt wurden.
6. Veränderung der Diagnostik für Hörverlust
6. Veränderung der Diagnostik für Hörverlust
Ohne die in der heutigen Form verfügbaren Möglichkeiten der Hochdurchsatz-Sequenzierung
beruhte die konventionelle klinische Evaluationen auf einer Reihe von klinischen Untersuchungen,
um ein möglichst detailliertes phänotypisches Bild zu erhalten, das eine gerichtete
molekulargenetische Analyse leitete ([Abb. 8]) [44]
[45]. Im Ausschlussverfahren folgte dann häufig die molekulargenetische Einzeluntersuchung
mit der Sequenzierung des Connexin-26-Gens GJB2. Mutationen im Gen GJB2 sind in erster Linie mit einer autosomal-rezessiven Form des nicht-syndromalen Hörverlusts
assoziiert. In Deutschland ist dieses Gen für die Diagnose von etwa jedem fünften
Patienten mit genetischem Hörverlust verantwortlich [46]. In einer eigenen Studie haben wir bei ca. 17% der Cochlea-Implantat-Kandidaten,
die sich einer molekulargenetischen Untersuchung auf Hörverlust unterzogen, pathogene
Varianten von GJB2
[47] identifiziert. In den vergangenen Jahrzehnten wurde der Erfolg dieses Screening-Verfahrens
durch die geringe Länge des GJB2 Gens, die eine einfache Sequenzierung ermöglicht, und die relativ hohe Diagnoserate
unterstützt [48]. Wenn die klinische Evaluation auf eine bestimmte Form eines syndromalen Hörverlust
hinwies, wurde versucht auf der Basis dieser klinischen Verdachtsdiagnose eine gezielte
Sangersequenzierung von Kandidatengenen durchzuführen. Die Leitung der genetischen
Analyse durch phänotypische Daten konnte bei einer genetisch hochheterogenen und phänotypisch
sehr variablen Erkrankung wie der Schwerhörigkeit jedoch nur begrenzten Erfolg bieten
und beschränkte sich daher auf wenige Gene mit einer klaren Genotyp-Phänotyp-Korrelation.
Die molekulargenetischen Untersuchung von Einzelgenen war langsam, arbeitsintensiv,
teuer und führte oft zu wenig informativen Ergebnissen bzw. ließen die genetische
Ursache ungeklärt [49]. Darüber hinaus sind die meisten Formen des Hörverlusts nicht-syndromal, das heißt
klinisch konnten keine spezifischen phänotypischen Merkmale identifiziert werden.
Damit war die Diagnostik nach Ausschluss einer GJB2-Mutation hinaus auf Basis von Einzelgenuntersuchungen eine Herausforderung und konnte
nicht erschöpfend durchgeführt werden. Die phänotypische Variabilität von Schwerhörigkeit
macht es nahezu unmöglich, eine prädiagnostische Hypothese durch klinische Untersuchung
und audiologische Befunde aufzustellen. Das reine Screening anderer Kandidaten Gene
war zu teuer, zu langwierig und oft auch methodisch auf wenige Gene beschränkt.
Abb. 8 a Klassische Abfolge der Hördiagnostik. Die Reihenfolge beginnt mit Anamnese, klinische
Untersuchung, audiologische Prüfung, Bildgebung, Zusatzuntersuchung (z. B. Labordiagnostik,
Schilddrüsenfunktionsprüfung, EKG), Konsiluntersuchungen (z. B. Ophthalmologie, Neurologie,
Kardiologie) und endet schließlich mit der humangenetischen Untersuchung auf Basis
der Einzelgendiagnostik. Genetische Ursachen können nach diesem Vorgehen per Ausschlussdiagnostik
in der Regel nur angenommen werden, können aber meist nicht direkt nachgewiesen werden.
b Zukünftige Abfolge der Hördiagnostik unter Einbeziehung einer umfassenden genetischen
Diagnostik. Der direkte Nachweis einer genetischen Ursache wird bereits nach der Anamnese,
klinischen Untersuchung und audiologischen Prüfung angestrebt. Der klinische Phänotyp
kann bei der genetischen Befundbeurteilung wertvolle Hinweise liefern. Im Falle des
Nachweises einer syndromalen Form der Schwerhörigkeit können dann gezielt weiter Zusatzuntersuchung
und Konsiluntersuchungen veranlasst werden. Verändert nach Löwenheim, 2014 [45].
In zurückliegenden Jahrzehnt hat sich ein richtungsweisender Übergang von der Einzelgen-Sequenzierung
zur Hochdurchsatz-Sequenzierung für die genetische Diagnostik vieler Erkrankungen,
insbesondere auch des Hörverlusts, vollzogen [50]. Mithilfe dieser Technologie können bis dahin unvorstellbar großen Datenmengen generiert
und ausgewertet werden. Trotz der für die Schwerhörigkeit bestehenden genetischen
Heterogenität können in kurzer Zeit und zu geringen Kosten verwertbare Ergebnisse
erzielt werden. Aktuelle diagnostische Ansätze nutzen entweder erkrankungsspezifische
Gen-Panels oder die Exom-Sequenzierung. Das Exom umfasst die potenziell für Proteine
kodierenden Regionen der DNA, die etwa 1 bis 2% des gesamten Genoms ausmachen. Der
strategische Übergang zu den Methoden der Hochdurchsatz-Sequenzierung verändert das
diagnostische Vorgehen in der Patientenversorgung. Die deutlich verbesserte Zugänglichkeit
der genetischen Diagnostik rückt damit in im Verhältnis zu breit angelegten klinischen
Untersuchungen in den Vordergrund.
Die Hochdurchsatz-Sequenzierung bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber Einzelgen-Ansätzen,
z. B. werden zeitgleich viele Patienten in einem standardisierten Verfahren im Labor
untersucht. Insbesondere können alle bekannten Gene im Zusammenhang mit Hörverlust
in einer einzigen Reaktion sequenziert und parallel analysiert werden. Dies ermöglicht
einen hypothesenfreien Zugang zur genetischen Diagnostik. Da Syndrome wie Usher- oder
Pendred-Syndrome erst Jahre nach Beginn eines Hörverlusts klinisch als syndromale
Erkrankung auffällig werden, war es bisher kaum möglich, in diesen Fällen die genetisch
bedingte Hörstörung vor Auftreten der übrigen Symptome trotz eingehender klinischer
Untersuchung genau zu diagnostizieren. Bei syndromaler Schwerhörigkeit kann eine frühe
Diagnose vor Eintreten von Begleitsymptomen klinische Untersuchungen ersparen, ermöglicht
eine prognostische Einschätzung und eine Beratung über weitere Behandlungsmöglichkeiten
[50]. Bei nicht-syndromaler Schwerhörigkeit können betroffene Patienten mit gut charakterisierten
pathogenen Varianten ebenfalls eine prognostische Bewertung und eine personalisierte
Auswahl von Therapie und Hörrehabilitation nutzen.
6.1 Gen-Panel-Diagnostik bei Hörverlust
Gen-Panels stellen einen selektiven und spezifischen Ansatz für die molekulargenetische
Diagnostik dar, da sie auf krankheitsassoziierte Gene in einem bestimmten Krankheitsgebiet
fokussieren. Das Panel-Design beinhaltet die Auswahl von Genen auf der Grundlage des
aktuellen Wissens für ein individuelles „Köder“-Design (engl.: bait design). Diese Köder werden aus Oligonukleotiden hergestellt, die komplementär
zu denen für eine bestimmte Erkrankung in Frage kommenden Zielregionen/Exons ausgewählt
werden. Anreicherung (engl: „Targeted Genomic Enrichment“) oder „Sequence Capture“ sind Begriffe, die die Auswahl
der gewünschten DNA-Regionen zur Amplifikation und Anreicherung bei der Erstellung
einer sogenannten Sequenzierungsbibliothek beschreiben. Eine Bibliothek enthält den
kompletten Satz von ausgewählten und angereicherten Fragmenten, die für das Krankheitsbild
von Interesse sind. Bevor Gen-Panels in einem diagnostischen Bereich verwendet werden,
durchlaufen sie Gen-Auswahl- und Designschritte. Darüber hinaus werden die Sequenzierungsdaten
zunächst einer Validierung und Optimierung auf Qualität und Homogenität unterzogen.
Dies hat zur Folge, dass die Sequenzierungsabdeckung (engl.: Coverage) über den Gen-Satz hinweg eine größere Homogenität mit weniger „Lücken“
(oder Basen mit schlechter oder keiner Abdeckung) aufweist. Der Einsatz methodisch
gut abgedeckter Gene ist wichtig für eine umfassende Sequenzanalyse der Varianten,
die sich in diesen Regionen befinden können. Gen-Panels besitzen also den Vorteil
einer spezifisch auf eine bestehende klinische Fragestellung wie der Schwerhörigkeit
gerichtete Diagnostik bei gleichzeitig hoher qualitativer Aussagekraft.
6.2 Exom-Diagnostik bei Hörverlust
Die Exom-Sequenzierung reichert alle derzeit bekannten Gene und Gen-Isoformen an und
beschränkt sich nicht auf die für ein bestimmtes Krankheitsgebiet bekannten Gene.
Es gibt viele kommerziell erhältlich Kits zur Bibliothekserstellung für die Exom-Sequenzierung,
die ständig verbessert werden. Viele Anbieter erlauben es den Anwendern auch, den
Gehalt an spezifischen „Ködern“ zu erhöhen, um die gewünschte Sequenzierung von Zielregionen
zu verbessern. Auch können bekannte pathogene Varianten, die sich nicht in exomischen
Regionen befinden und ansonsten völlig übersehen werden würden, mit einbezogen werden.
Da Exome einen wesentlich größeren Anteil der genomischen Sequenz im Vergleich zu
Gen-Panels anreichern, ist die Sequenzierqualität von Exom-Datensätzen im Vergleich
zu Gen-Panels tendenziell geringer. Entgegen diesem Ruf einer geringeren diagnostischen
Qualität ist die exombasierten Diagnostik jedoch nach deutlicher Optimierung inzwischen
erfolgreich in das klinische Umfeld integriert [51]
[52]
[53]
[54]. Die Sanger-Sequenzierung von eingeschränkt abgedeckten Regionen kann diese Methode
gut ergänzen.
Bei der Exom-Sequenzierung wird die Analyse für die Diagnostik am effizientesten durch
ein so genanntes in silico Gen-Panel gesteuert. Ähnlich den primären Gen-Panels wird hier die Analyse auf klinisch
relevante Gene beschränkt, um Zeit zu sparen und eine Diagnose zügig stellen zu können.
Dieser Genauswahlprozess ermöglicht eine Analyse, die alle Gene umfasst, die für den
spezifischen Phänotyp des Patienten von klinischer Bedeutung sind und die einen bestimmten
Abdeckungsgrenzwert erfüllen. Dies eröffnet verbesserte Möglichkeit zur Variation
dieser Geninhalte als dies bei klassischen primären Gen-Panels der Fall ist, die auf
einen festen, immer gleichen Gen-Satz beschränkt sind.
6.3 Vor- und Nachteile von Gen-Panels und exombasierten Diagnostikansätzen
Es gibt mehrere Vorteile bei der Auswahl von Gen-Panels für Hörverlust gegenüber der
Exom-Sequenzierung. Ein Argument für die Auswahl von Gen-Panels gegenüber der Exom-Sequenzierung
ist, dass die produzierten Daten spezifisch für die in Frage stehende Primärerkrankung
sind. Dies bedeutet, dass Gene, die mit anderen Erkrankungen in Zusammenhang stehen,
nicht sequenziert werden und die Analyse und die genetischen Ergebnisse auf die primäre
Indikation beschränkt bleiben. Mit anderen Worten: Laboratorien, die die Gen-Panel-Diagnostik
nutzen, müssen nicht das Potenzial von Sekundärbefunden berücksichtigen, die für den
Patienten von klinischer Bedeutung sein können, aber nicht in Zusammenhang mit der
primären Indikation stehen. Expertengruppen des American College of Medical Genetics
haben Richtlinien für die Meldung von Sekundärbefunden in mindestens 59 medizinisch
verwertbaren Genen bei der klinischen Genomsequenzierung empfohlen [55]. Die überwiegende Zahl dieser Gene betrifft autosomal-dominante Erkrankungen, die
typischerweise erst im Erwachsenenalter symptomatisch werden. Zufällige Varianten
werden unabhängig vom Alter des Patienten gemeldet, jedoch sind Erkrankungen, die
zum Neugeborenen-Screening gehören, ausgeschlossen. Im Jahr 2013 veröffentlichte die
Deutsche Gesellschaft für Humangenetik Richtlinien für die Rückmeldung von Zusatzbefunden,
die das Zustimmungsverfahren und das Recht des Patienten, diese Ergebnisse nicht zu
kennen oder nicht zu erhalten, beinhalten [56]. Diese Richtlinien spezifizieren keine sekundären Befunde, die in einem bestimmten
Satz von Genen gefunden wurden, vielmehr werden vier Kategorien definiert, in die
eine Variante fallen kann. Es wird v. a. ermutigt, Zusatzbefunde zu melden, für die
Behandlungsmethoden existieren und über die Betroffenen informiert werden wollen.
Damit geht die Exom-Sequenzierung in ihrer diagnostischen Abdeckung aber weit über
die ursprüngliche Fragestellung bspw. einer bestehenden Schwerhörigkeit hinaus. Für
den eine genetische Untersuchung veranlassenden Facharzt gehen die möglichen Befunde
dann auch potenziell weit über das eigene Fachgebiet hinaus.
Da bei der Sequenzierung von vordefinierten Gen-Panels im Vergleich zur Exom-Sequenzierung
eine kleinere und spezifisch auf eine Erkrankung ausgerichtete Gruppe von Genen angereichert
und analysiert wird, ist die Abdeckung der Gene in der Regel viel höher, und das spezifische
„bait design“ kann sehr gut auf schwer zu sequenzierende Regionen abzielen (d. h.
GC-reiche Regionen, repetitive DNA-Sequenzen, die als Tandem-Wiederholungen bezeichnet
werden, und ungleichmäßig fragmentierte DNA-Bereiche). Dies bedeutet, dass die Sensitivität
(Falsch-Negativ-Rate) und Spezifität (Falsch-Positiv-Rate) von Detektionsvarianten
deutlich verbessert werden kann. Weiterhin können falsch-positive Ergebnisse aus Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten
zuverlässig mittels Sanger-Sequenzierung entdeckt und validiert werden. Die einheitliche
Abdeckung unterstützt auch eine konsistentere Detektion von Kopienzahl Abweichungen.
Die Daten, die bei der Gen-Panel-Sequenzierung generiert werden, sind deutlich kleiner
als bei der Exom-Sequenzierung. Dies vereinfacht auch die Datenspeicherung wesentlich.
Die Exom-Sequenzierung wiederum bietet einige Vorteile gegenüber den primären Gen-Panels.
So besteht die Möglichkeit die erhobenen Daten zu einem späteren Zeitpunkt erneut
zu analysieren und neu-ursächliche Gene einzuschließen. Dies kann für Patienten, bei
denen die Analyse der bekannten Gene ergebnislos bleibt zur Diagnosesicherung beitragen.
Die Geschwindigkeit der Entwicklungen in der Genom-Diagnostik führt zur Identifikation
immer neuer Gene. Gen-Panels erfordern eine regelmäßige Aktualisierung der Geninhalte
und werden anschließend einer Validierung unterzogen. Erst nach diesen Schritten kann
die DNA des Patienten erneut überprüft werden. Dieses Verfahren ist aufwendiger und
teurer als die Generierung eines Exom-Datensatzes. Bei der Exom-Sequenzierung können
molekulargenetische Untersuchungen von Patienten mit einer Vielzahl unterschiedlicher
Erkrankungen parallel geprüft werden, und dadurch die Durchlaufzeiten für Laboruntersuchungen
deutlich reduziert werden. Bei primären Gen-Panels sind je nach Labor und Anzahl der
Testanforderungen müssen die Labors oft mehrere Wochen oder sogar Monate Wartezeit
erforderlich, bis genügend DNA von Patienten mit der Fragestellung Hörverlust eingetroffen
ist, um ein Gen-Panel zu erstellen und zu sequenzieren.
6.4 Diagnostische Aufklärungsraten
Obwohl die bereits umfangreiche Liste der am Hörverlust beteiligten Gene derzeit noch
unvollständig ist [57], haben sich die diagnostischen Aufklärungsraten bei genetisch bedingten Hörverlusten
in Deutschland [47]
[58]
[59] und weltweit [60] seit der Implementierung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätzen in die Routinediagnostik
deutlich verbessert. Um dies zu veranschaulichen, wird eine Reihe von Studien dargestellt,
die über diagnostische Aufklärungsraten einschließlich GJB2 auf der Basis von Hochdurchsatzsequenzierung berichten ([Abb. 9]). In diesen Studien variierte die Methodik von Gen-Panels [58]
[61]
[62]
[63] bis hin zur Exom-Sequenzierung [54], die Anzahl der analysierten Gene war nicht einheitlich, und auch die Analyse der
Kopienzahl-Variation wurde nicht in allen Studien konsequent durchgeführt. Die diagnostischen
Aufklärungsraten reichten in Abhängigkeit von der Anzahl der eingeschlossenen Gene
von 16% in einer Studie, die 19 Gene auf einem Oligo-Hybridisierungs-Array [64] umfasste, bis zu 54% [47] einer eigenen Untersuchung, in der ein Gen-Panel mit bis zu 128 Genen für Hörverlust
verwendet wurde. Betrachtet man die in den verschiedenen Studien am häufigsten von
Mutationen betroffenen Gene ([Tab. 1]), so zeigt sich, dass sich die fünf am häufigsten betroffenen Gene z. T. unterscheiden.
Die Ausnahme bleibt GJB2, das stets als das am häufigsten betroffene Gen identifiziert wird. Die unterschiedlichen
Ergebnisse können mit dem unterschiedlichen ethnischen Hintergrund der Patienten und
der variablen Anzahl der untersuchten Gene und Patienten erklärt werden.
Abb. 9 Diagnostische Aufklärungsraten in ausgewählten Hochdurchsatz-Sequenzierungsstudien.
a Übersicht über die diagnostische Aufklärungsrate bei Patienten mit Hörverlust, die
sich einem Gentest unterziehen. b Es besteht eine positive Korrelation zwischen der diagnostischen Aufklärungsrate
und der Anzahl der untersuchten Gene.
Tab. 1 Die am häufigsten betroffen Gene aus ausgewählten Studien.
|
Autor
|
Hernandez et al., 2010
|
Sloan-Hegen et al., 2016
|
Zazo Seco et al., 2016
|
Baux et al., 2017
|
Alkowari et al., 2017
|
Sommen et al., 2016
|
Tropitzsch et al., 2013
|
|
Land
|
USA
|
USA
|
Niederlande
|
Frankreich
|
Katar
|
Belgien
|
Deutschland
|
|
Patienten
|
44
|
1119
|
200
|
207
|
81
|
160 families
|
154
|
|
GJB2
|
|
1.
|
1.
|
1.
|
|
1.
|
1.
|
|
MYO15A
|
|
5.
|
3.
|
4.
|
|
2.
|
3.
|
|
SLC26A4
|
|
3.
|
|
|
|
|
|
|
MYO7A
|
1.
|
|
4.
|
3.
|
|
2.
|
2.
|
|
CDH23
|
2.
|
|
4.
|
5.
|
1.
|
|
|
|
OTOF
|
|
|
5.
|
|
3.
|
|
|
|
USH2A
|
3.
|
|
2.
|
4.
|
|
|
|
|
TMC1
|
|
|
|
|
2.
|
2.
|
|
|
MYO6
|
|
|
|
|
3.
|
|
5.
|
|
TECTA
|
|
4.
|
|
4.
|
|
|
4.
|
|
STRC
|
|
2.
|
3.
|
2.
|
|
|
|
|
LOXHD1
|
|
|
4.
|
|
|
|
|
|
TRIOBP
|
|
|
5.
|
|
|
|
|
|
OTOA
|
|
|
|
5.
|
2.
|
|
|
|
GJB6
|
|
|
|
|
4.
|
|
|
Eine umfassende molekulargenetische Diagnostik sollte die Analyse der Kopienzahl-Variation
[65] beinhalten. Eine der bisher größten Studien zu dieser Thematik ergab, dass etwa
15% der von Hörverlust betroffenen Patienten mindestens eine Kopienzahl-Variation
in einem mit Hörverlust assoziierten Gen trugen. Bei Patienten mit gesicherter erblicher
Schwerhörigkeit hatten 18,7% eine Variation der Kopienzahl, die zu der genetischen
Diagnose beitrug. Das Gen STRC ist das häufigste von Kopienzahl-Variationen betroffene Gen. STRC kodiert für das Protein Stereocilin, das in den Stereozilien der äußeren Haarzellen
lokalisiert ist. STRC weist in der europäischen Bevölkerung eine hohe Deletions-Trägerrate von ca. 1,6%
auf, die fast so hoch ist wie die bekannte c.35delG-Trägerrate (1,89%) für GJB2 in der gleichen Population [48]. Folglich sollte insbesondere für das Gen STRC (DFNB16) eine Analyse sowohl auf Deletionen als auch auf pathogene Varianten [65]
[66]
[67]
[68]
[69]
[70] erfolgen. STRC ist nur ein Beispiel für die Notwendigkeit zum Einschluss der Kopienzahl-Variation.
Die zunehmende Verbesserung der Aufklärungsraten mit bis zu 50% in der molekulargenetischen
Diagnostik belegt, dass bei allen Patienten mit Hörverlust eine Hochdurchsatz-Sequenzierung
zu empfehlen ist [49]. Patienten mit negativen genetischen Befunden und fortbestehendem klinischem Verdacht
auf eine hereditäre Schwerhörigkeit sollten in den folgenden Jahren einen erneuten
Test in Erwägung ziehen, da sich das Wissen über Gene und Variantentypen immer weiterentwickelt.
Unter Berücksichtigung von nicht-synonymen Mutationen, Spleißstellen-Mutationen (engl.:
„splice-site mutations“), Indels (Insertionen und Deletionen) und Kopienzahl-Variationen
in den kodierenden Regionen eines Gen-Panels könnte in Zukunft eine diagnostische
Aufklärungsrate von 88,3% erreicht werden [49] ([Abb. 8b]). Die aktuellen Fortschritte in der Genomik weisen darauf hin, dass auch nicht-kodierende
Regionen des Genoms an einer Erbkrankheit beteiligt sind [71]. Das Ausmaß der Beteiligung von Veränderungen in den nicht-kodierenden Regionen
des Genoms für Hörverlust muss noch aufgeklärt werden. Allerdings sind krankheitsassoziierte
intronische Varianten mit mehr als 20 Nukleotiden aus kodierenden Exons und so genannten
„deep intronic“-Varianten, die nicht in Standard-Gen-Panels und Exomen erfasst würden,
bereits in vielen Beispielen der Genetik von Schwerhörigkeit beteiligt [72]
[73]. Es ist naheliegend anzunehmen, dass in Zukunft ein erheblicher Anteil der schwerhörigen
Patienten mithilfe von Varianten nicht-kodierender Regionen diagnostiziert werden
kann, die Auswirkungen auf die Genexpression und das normale Spleißen von Genen haben.
Die molekulargenetische Diagnostik ist auf eine qualitativ hochwertige Sequenzierung
sowie effektive Analysestrategien der Bioinformatik angewiesen, die den Ausschluss
nicht relevanter Varianten unterstützen und gleichzeitig relevante Varianten für die
Expertenanalyse enthalten. Die Priorisierung der Varianten erfolgt typischerweise
durch den Einsatz verschiedener Tools und Datenbanken, von denen viele im nächsten
Abschnitt kurz beschrieben werden. Da sich die Hochdurchsatz-Sequenzierung immer weiterverbreitet,
steigt auch die Anzahl der Tools und Größe der Datenbanken exponentiell an.
7. Computer Ressourcen
Die Bioinformatik setzt rechenintensive Methoden zur Aufbereitung und Analyse von
Daten ein, um biologisch und medizinisch relevante Ergebnisse zu erhalten. Vorgelagerte
bioinformatische Prozesse, die an Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten beteiligt sind,
können im Rahmen dieser Übersicht nur kurz angesprochen werden. Sie beinhalten Datenvorverarbeitungsschritte,
die die Ausrichtung von Lese- oder Sequenzierungsdaten auf die Referenzsequenz des
menschlichen Genoms beinhalten, sowie Nachverarbeitungsschritte, die die Entfernung
von Duplikaten und die Neukalibrierung der Basisqualität beinhalten. Auch diese Verfahren
wurden kontinuierlich verbessert, um die Genauigkeit der Identifizierung von Varianten
zu erhöhen. Das durchschnittliche Exom enthält über 20 000 Varianten, von denen 500
als selten oder (noch) nicht in Varianten-Frequenzdatenbanken beschrieben sind [74]. Auch die Varianten, die in Gen-Panels nachgewiesen werden, können extrem selten
sein oder in der Interpretation unklar bleiben. Es gibt eine Vielzahl von Programmen
(engl.: „tools“), die zur Unterstützung der Analyse eingesetzt werden können, die
in [Tab. 2] zusammengefasst sind. Der folgende Abschnitt beschreibt, wie diese Datenbanken und
Programme auf Hochdurchsatz-Sequenzierungsdatensätze angewendet werden.
Tab. 2 Computergestützte Datenbanken und Analysewerkzeuge, die häufig bei der Interpretation
von genetischen Varianten verwendet werden.
|
Ressourcen für Gene und Phänotypen
|
|
Datenbank
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
GeneCards: The Human Gene Database
|
Integrative Datenbank, die Informationen über menschliche Gene sowie klinische und
funktionelle Informationen enthält.
|
✓
|
✓
|
[75]
https://www.genecards.org/
|
|
Hereditary Hearing Loss Homepage
|
Online-Datenbank für Gene, die an erblichem Hörverlust beteiligt sind.
|
✓
|
✓
|
[41]
http://hereditaryhearingloss.org
|
|
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)
|
Online Mendelschen Vererbung im Menschen Online-Ressource für Informationen über menschliche
Gene und genetische Phänotypen
|
✓
|
✓
|
[76]
https://www.omim.org/
|
|
Allelfrequenz-Datenbanken: nützlich zum Verständnis der Häufigkeit einer Variante
über verschiedene Ethnien hinweg
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
Database of Short Genetic Variations (dbSNP)
|
Datenbank mit genetischen Varianten
|
✓
|
✓
|
[77]
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/
|
|
Greater Middle East Variome Project (GME)
|
Großes Variome-Projekt im Nahen Osten Allelfrequenz-Referenzsatz aus der Exomesequenz
von 2.497 Individuen aus dem Nahen Osten.
|
✓
|
✓
|
[79]
http://igm.ucsd.edu/gme/index.php
|
|
Exome Aggregation Consortium (ExAC)
|
Exom Aggregations-Konsortium Allelfrequenz-Referenz-Set aus der Exomesequenz von 60.706
Individuen
|
✓
|
✓
|
[1]
http://exac.broadinstitute.org/
|
|
Exome Variant Server (EVS)
|
Exome Variantenserver Allelfrequenz-Referenz-Set aus der Exomesequenz von 6.503 Individuen
|
✓
|
✓
|
[78]
http://evs.gs.washington.edu/EVS/
|
|
Genome Aggregation Database (gnomAD)
|
Genom-Aggregationsdatenbank Allelfrequenz-Referenz-Set von Individuen, der 123.136
Exome und 15.496 Genome umfasst.
|
✓
|
✓
|
[1]
http://gnomad.broadinstitute.org/
|
|
Iranome
|
Allelfrequenz-Referenz-Set aus 800 Exomen, die verschiedene ethnische Gruppen im Iran
repräsentieren.
|
✓
|
✓
|
[80]
http://www.iranome.com/
|
|
In silico Pathogenitätsvorhersagewerkzeuge für die Variantenanalyse
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
Combined Annotation-Dependent Depletion (CADD)
|
Kombinierte Annotation Integration vieler Pathogenitätsannotationen in einen einzigen
Pathogenitätswert in Form von C-Scores zur Priorisierung von Funktionsvarianten.
|
✓
|
✓
|
[109]
https://cadd.gs.washington.edu/
|
|
MutationTaster
|
Programm zur Vorhersage der Pathogenität zur Bestimmung der Auswirkungen von Varianten
auf die DNA-Ebene
|
✓
|
✓
|
[82]
http://www.mutationtaster.org/
|
|
PolyPhen-2
|
Programm zur Bestimmung des Einflusses von Aminosäuresubstitutionen auf die Funktion
eines Proteins
|
✓
|
✓
|
[83]
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml
|
|
Sorting Intolerant from Tolerant (SIFT)
|
Programm zur Bestimmung des Einflusses einer Aminosäuresubstitution aus Missense-
und Indelvarianten auf die biologische Funktion eines Proteins
|
✓
|
✓
|
[84,85]
http://sift.jcvi.org
http://sift-dna.org/sift4g
|
|
Spleißvarianten Vorhersage Tool
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
Human Splicing Finder
|
Programm zur Vorhersage der Auswirkungen von Varianten auf die Spleißergebnisse.
|
✓
|
✓
|
[88]
http://www.umd.be/HSF3/
|
|
GeneSplicer
|
Programm zur Vorhersage der Auswirkungen von Varianten auf die Spleißergebnisse.
|
✓
|
✓
|
[89]
http://www.cbcb.umd.edu/software/GeneSplicer/gene_spl.shtml
|
|
MaxEntScan
|
Programm zur Vorhersage der Auswirkungen von Varianten auf die Spleißergebnisse.
|
✓
|
✓
|
[90]
|
|
NNSPLICE
|
Programm zur Vorhersage der Auswirkungen von Varianten auf die Spleißergebnisse.
|
✓
|
✓
|
[91]
|
|
Klinisch orientierte Datenbanken zur Varianteninterpretation
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
ClinVar
|
Datenbank, die genetische Varianten mit Phänotypassoziationen und unterstützenden
Beweisen berichtet.
|
✓
|
✓
|
[92]
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
|
|
The Connexin-deafness Homepage
|
Variantendatenbank für die Gene GJB1, GJB2, GJB3, GJB3, GJB6
|
✓
|
✓
|
http://davinci.crg.es/deafness/index.php
|
|
Deafness Variation Database (DVD)
|
Expert-kurierter Katalog der genetischen Variation in taubheitsassoziierten Genen
|
✓
|
✓
|
[42]
http://deafnessvariationdatabase.org/
|
|
Human Gene Mutation Database (HGMD)
|
Eine Datenbank, die alle bekannten Varianten annotiert, die für die menschliche Erbkrankheit
verantwortlich sind.
|
✓
|
✓
|
[43]
http://www.hgmd.cf.ac.uk/
|
|
Leiden Open Variation Database 3.0 (LOVD v.3.0)
|
Datenbank mit einer Gen orientierten Sammlung von DNA-Varianten
|
✓
|
✓
|
[93]
https://www.lovd.nl/3.0/home
|
|
Tools zur Analyse der evolutionären Konservierung
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
phyloP
|
Datenbank zur Konservierung von Nukleotidesequenzen
|
✓
|
✓
|
[104]
|
|
Grantham distance
|
Eine Quantifizierung des physikalisch-chemischen Abstandes zur Messung biochemischer
Unterschiede zwischen nativen und substituierten Aminosäuren.
|
✓
|
✓
|
[105]
|
|
Genexpressionsdatenbanken
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
gEAR Portal
|
Datenbank, die zelltypspezifische Genexpression basierend auf Microarray-Genexpression
und RNAseq-Daten zeigt.
|
✓
|
✓
|
[100]
https://gear.igs.umaryland.edu/
|
|
Shared Harvard Inner-Ear Laboratory Database (SHIELD)
|
Maus- und Hühner-Innenohr-Expressionsdatensätze, die RNAseq-, ChIP-Seq- und GeneChip-Daten
enthalten.
|
✓
|
✓
|
[99]
Shen et al., 2015
https://shield.hms.harvard.edu
|
|
Audiologisch basiertes Genotyp-Phänotyp-Tool
|
|
Database
|
Hintergrund
|
Diagnosetool
|
Recherchetool
|
Referenz/URL
|
|
Audiogene
|
Ein Programm zur Verwendung audiometrischer Daten, um vorherzusagen, welche Gene bei
Patienten mit autosomal dominantem Hörverlust betroffen sein könnten.
|
✓
|
✓
|
[96-98]
https://audiogene.eng.uiowa.edu/
|
Mehrere Datenbanken enthalten Informationen über menschliche Gene, wie GeneCards [75] und die „Online Mendelian Inheritance in Man“ (OMIM) [76] Webseite. Diese Ressourcen enthalten Zusammenfassungen über klinische und funktionelle
Informationen zu den derzeit charakterisierten Genen. In Bezug auf Hörverlust listet
die „Hereditary Hearing Loss Homepage“ [41] die Orte und Gene auf, die an nicht-syndromalem Hörverlust beteiligt sind. Auch
die häufigsten Syndrome mit Hörverlust sind verzeichnet. Viele Laboratorien wählen
die Genlisten für ihre Gen-Panel-Inhalte für die Panel-Sequenzierung mithilfe dieser
Datenbanken aus.
„Variant Frequency Database“ Repositorien wurden von großen Netzwerken internationaler
Kollaborationen entwickelt, um Informationen über Häufigkeit von Varianten im Exom
oder Genom darzustellen. Die Kenntnis der Häufigkeit einer Variante kann die Interpretation
enorm erleichtern. Wenn z. B. ein Patient einen autosomal-dominanten Hörverlust hat
und eine seltene Variante nicht nur in einem heterozygoten Zustand vorliegt, sondern
bei anderen vermutlich normal hörenden Patienten homozygot auftritt, dann spricht
dies gegen die Pathogenität im Rahmen eines autosomal-dominanten Erbgangs. Bei Schlussfolgerungen
ist somit Vorsicht geboten, wie am weiter unten beschriebenen Beispiel von GJB2 c.35delG gezeigt wird. Dennoch sind diese Datenbanken nützliche Werkzeuge, um die
Häufigkeit einer Variante zu verstehen und damit Belege für oder gegen Pathogenität
zu liefern. Zu beachten ist jedoch, dass nur, weil eine Variante häufig ist, das per
se nicht unbedingt bedeutet, dass sie gutartig ist oder umgekehrt, weil eine Variante
selten oder neu ist, sie nicht notwendigerweise pathogen ist.
Eine der ersten Datenbanken zur Dokumentation von genetischen Variationen war die
„Database of Short Genetic Variants“, später abgekürzt dbSNP [77], die alle identifizierten genetischen Variationen wie einzelne Nukleotidpolymorphismen
und Indels in den Genomen des Menschen und vieler anderer Arten dokumentieren soll.
Weitere unabhängige Datenbanken haben sich im Laufe der Jahre entwickelt, wie der
„exome variant server“ (EVS), der die Exomdaten von 6 500 europäischen und afroamerikanischen
Individuen enthält [78]. Noch größere Datenbanken, wie der „Exome Aggregation Consortium Browser“ (ExAC),
der Variantenfrequenzen aus den Exomdaten von 60 706 Individuen zeigt. Die ExAC wurde
später auf 123 136 Exome und 15 496 Genome in einer erweiterten Datenbank namens „Genome
Aggregation Database“ (gnomAD) [1] erweitert. In dieser Datenbank wurden die Variantenfrequenzen in vielen Teilpopulationen
wie Latino, Nicht-Finnisch-Europäisch und Finnisch-Europäisch, Afrikanisch, Ashkenazi-Jüdisch,
Ostasien, Südasien und „andere“ Individuen, die diesen Populationen nicht zugeordnet
werden können, untersucht. Während der Entwicklung dieser Datenbanken wurde deutlich,
dass es viele unterrepräsentierte Subpopulationen gab, die die Entwicklung einer Reihe
anderer Datenbanken auslösten, nämlich des „Greater Middle Eastern Variome“ (GME),
das die Exomdaten von 2 498 Individuen aus verschiedenen Ländern des Nahen Ostens
[79] und des „Iranome“, das die Exomdaten von 800 Individuen aus 8 verschiedenen ethnischen
Gruppen im Iran enthält [80]. Weitere Anstrengungen zur Erfassung der genomischen Variation in seltenen und isolierten
menschlichen Populationen werden notwendig sein, um die einzigartigen Varianten zu
verstehen, die nur in diesen Populationen existieren. Von diesen seltenen Populationen
kann man viel über das menschliche Genom und den Zusammenhang zwischen Varianten und
Krankheiten lernen.
Eine der aussagekräftigsten Strategien zur Bestimmung der Pathogenität einer Variante
ist die funktionelle Validierung und experimentelle Prüfung. Dies ist jedoch in klinischen
Labors nicht möglich, die genetische Ergebnisse innerhalb eines begrenzten Zeitrahmens
an ihre Auftraggeber melden müssen. Klinische Genetiker sind daher für die Analyse
der Pathogenität von Missense-Varianten auf in silico-Pathogenitätsvorhersagen ausgewichen. Diese Programme verwenden Algorithmen, die
für Varianten Pathogenitätswerte zuweisen, die Informationen über die evolutionäre
Konservierung und den Einfluss der Aminosäuresubstitution auf die Proteinstruktur
berücksichtigen [81]. Da die klinische Validierung in diesen Programmen nicht durchgeführt wird, werden
in der Regel mehrere Programme parallel genutzt, um die möglichen Ergebnisse zu verstehen.
Einige dieser Programme sind in [Tab. 2] dargestellt. Das Programm „MutationTaster“ [82] und „PolyPhen-2“ [83] untersuchen die Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf die Proteinstruktur, während
„SIFT“ [84]
[85] zusätzlich die Wirkung von Indel-Varianten auf die Struktur vorhersagt.
Messenger RNA (mRNA) Spleißen ist der Prozess des Entfernens der intronischen Sequenz,
die keine Aminosäuren kodiert, und des Spleißens der kodierenden exonischen Sequenz
zu einem einzigen Transkript. Genetische Varianten, die den normalen Spleißprozess
stören, können die Genexpression und die resultierenden Proteinprodukte wesentlich
beeinflussen und zur Entstehung genetischer Erkrankungen beitragen [86]
[87]. Varianten, die das korrekte Spleißen von Genen beeinflussen, können weit entfernt
von den normalen Intron-Exon-Sequenzgrenzen liegen. Es ist wichtig, die möglichen
Auswirkungen dieser Varianten zu verstehen. Daher wurde eine Reihe von Programmen
entwickelt, wie z. B. „Human Splicing Finder“ [88], „GeneSplicer“ [89], „MaxEntScan“ [90] und „NNSPLICE“ [91]. Diese Programme vergleichen die normale und die alterierte Sequenz auf eine Veränderung
in konservierten Sequenzen, die für den Ablauf normaler Spleißmechanismen verwendet
werden.
Die Interpretation von Varianten und deren Übersetzung in verwertbare klinische Ergebnisse
stellt eine große Herausforderung dar. Gerade vor dem Hintergrund der Flut von genomischen
Daten, die derzeit relativ kostengünstig und einfach zu generieren sind, haben klinische
Genetiker die Aufgabe, viele seltene Varianten zu verstehen, die ein Mosaik normaler
Variationen und potenziell krankheitsrelevanter Veränderungen darstellen. Eine Reihe
von Datenbanken wie „ClinVar“ [92], „HGMD“ [43] und die „Leiden Open Variation Database“ (LOVD) [93] dokumentieren Interpretationen von Varianten im klinischen Kontext. Wenn Varianten
in diesen Datenbanken enthalten sind, bieten sie in der Regel eine Interpretation
und einen Link zu Publikationen, die diese Interpretation und klinische Informationen
beschreiben. Viele dieser Datenbanken sind auf Experten angewiesen, die diese Informationen
weitergeben, oder sie haben einen Stab von Varianten-Kuratoren, die dies für die Datenpflege
tun. Es besteht die Gefahr, dass die Pathogenität der veröffentlichten Varianten nicht
genau verstanden wird oder der Grad der Unsicherheit nicht korrekt kommuniziert wird.
Somit können irrtümlich aufgenommene Varianten diese Datenbanken mit Fehlinformationen
„verschmutzen“. Folglich sind diese Datenbanken dafür bekannt, dass sie falsch-positive
Ergebnisse enthalten auch wenn sie eine sehr hilfreiche Quelle für klinische Genetiker
sein können. Fehlinformationen können sich ungünstig auf die Diagnosestellung für
die Patienten auswirken, zu einer ineffizienten Nutzung der Ressourcen führen und
die Entdeckung wahrer Gen- und Variantenassoziationen behindern [94]. 8,5% der Varianten, die bei HGMD als krankheitsassoziiert gemeldet wurden, waren
auch in einem Pool von über 1 000 asymptomatischen Individuen vorhanden, was darauf
hindeutet, dass diese Varianten möglicherweise fälschlicherweise mit einer Krankheit
in Verbindung gebracht wurden oder die Penetranz niedriger als erwartet war [8].
Die Folgen einer falschen Priorisierung von Varianten betreffen auch die Identifizierung
von Genen und führen zu falschen Gen-Krankheitsassoziationen. Im Jahr 2014 wurde das
Gen MYO1A als Gen für autosomal-dominante nicht-syndromale Schwerhörigkeit disqualifiziert.
Dies gelang durch die Beobachtung einer disharmonischen Segregation von einer Missense-
und 2 Nonsense-Varianten in 3 verschiedenen Familien [95]. In allen 3 Familien wurde die molekulargenetische Diagnose durch andere Gene für
Schwerhörigkeit gesichert, die dem Phänotyp der Patienten entsprachen. Dies unterstreicht
die Bedeutung der Analyse einer umfassenden Anzahl von mit Hörverlust assoziierten
Genen, um eine Diagnose stellen zu können. In diesen Familien wurden auch bei normal
hörenden Personen die vermutete pathogene Variante MYO1A nachgewiesen, was auch klar gegen eine Pathogenität spricht. Falsch assoziierte Gene
können erhebliche Auswirkungen auf die genetische Beratung, das Krankheitsmanagement
und sogar auch auf die Familienplanung haben.
Darüber hinaus verwenden klinische Laboratorien, die Varianten und klinische Informationen
austauschen, unterschiedliche Interpretationskriterien, weshalb diese Informationen
sorgfältig geprüft werden müssten. Die „deafness variation database“ (DVD) [42] ist die einzige von Experten kuratierte Datenbank, die der Kommentierung jeder Variante
in jedem Schwerhörigkeits-Gen gewidmet ist. Die strenge Analyse der in dieser Datenbank
enthaltenen Varianten hat zuvor als „pathogen“ erkannte Varianten als „gutartig“ neu
re-priorisiert. Dies erfolgte auf der Grundlage der Häufigkeit der gemeldeten Varianten
in mehreren Populationen und der Berücksichtigung der Unterschiede dieser Varianten
über mehrere Populationen hinweg. Die Studie, aus der die DVD hervorging, ergab, dass
93 Varianten von Genen für Schwerhörigkeit von „pathogen“ zu „gutartig“ re-kategorisiert
wurden. Dies entsprach über 4% der identifizierten Varianten. Diese Datenbank ist
auch mit einem „machine-learning“ basierten audiometrischen „Profiling-Tool“ namens
„AudioGene“ [96]
[97]
[98] verbunden, um Genotypen aus audiometrischen Daten von autosomal-dominanten Formen
von Hörverlust vorherzusagen. Datenbanken wie AudioGene nutzten Unterschiede in autosomal-dominanten
Audiogrammen und berücksichtigen Alter und Fortschreiten des Hörverlusts [98]. Einige Beispiele von AudioGene werden im Zusammenhang mit der Bedeutung des „Phänoms“
beschrieben ([Abb. 12]).
Das Verständnis der Genexpression im Innenohr ist im klinisch diagnostischen Umfeld
weniger relevant, ist aber bei der Identifikation neuer Schwerhörigkeits-Gene von
wesentlicher Bedeutung. Traditionelle Expressionsdatenbanken enthalten eine Vielzahl
von Geweben, aber keine Informationen über die Expression von Genen im Innenohr. Um
dieses Defizit auszugleichen, sind eine Reihe von Datenbanken entstanden, die sich
auf die Expression von Genen im Innenohr spezialisiert haben. Die „Shared Harvard
Inner-Ear Laboratory Database“ (SHIELD) [99] nutzt die RNA-Sequenzierung, um einen Überblick über die Genexpression von 4 Entwicklungsstadien
(E16, P0, P4 und P7) der Maus-Cochlea und Utrikel zu erhalten. Eine weitere Datenbank
namens „gEAR Portal“ [100] enthält Genexpressionsinformationen aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Maus
sowie Zebrafische. Expressionsmuster für das humane Innenohr sind nur fragmentarisch
vorhanden.
8. Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalyse
8. Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalyse
Für Fachärzte der Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, die keine eigenen praktischen Erfahrungen
in der genetischen Datenanalyse haben, ist es eine Herausforderung, die unterschiedlichen
Verfahren der Hochdurchsatzsequenzierung in ihrer diagnostischen Validität einzuordnen.
Die Diskussion um falsch-positive Ergebnisberichte zeigt [101], dass die Varianteninterpretation sehr komplex ist. Der nächste Abschnitt zielt
darauf ab, die wichtigsten Schritte zu entmystifizieren, zu vereinfachen und darzustellen
wie Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten aktuell verarbeitet und analysiert werden.
Gen-Panel-, Exom- und Genom-Sequenzierungsdaten bestehen aus Millionen von Ablesungen
(engl.: „reads“), die in einer FASTQ-Datei enthalten sind. Jede Probe hat 2 FASTQ-Dateien
(read 1 und read 2), die die bidirektionale Ausrichtung der Sequenzierung darstellen
([Abb. 10]). Diese Dateien enthalten auch Basisaufruf- und Qualitätsinformationen und werden
als Sequenzeingabe für die Ausrichtung oder Abbildung auf die menschliche Referenzgenomsequenz
verwendet. Bei der Ausrichtung werden die Millionen von Ablesungen von kurzen DNA-Abschnitten
an der richtigen Stelle des menschlichen Referenzgenoms organisiert. Die Visualisierung
der Leseausrichtung kann die Tiefe oder Abdeckung pro Basis anzeigen, d. h. die Anzahl
der Ablesungen an jeder Basisposition ([Abb. 10]). Nach dem Ausrichten der Ablesungen werden Varianten aufgerufen, die dann einer
sogenannten Variantenfilterung unterzogen werden, die benutzerdefinierte Parameter
verwendet, um die für die manuelle Analyse verbleibenden Varianten zu reduzieren ([Abb. 11]).
Abb. 10 Hochdurchsatz-Sequenzierung am Beispiel der GJB2 c.35delG-Deletion. a Eine visuelle Darstellung einiger Merkmale der Hochdurchsatz-Sequenzierung. b Stammbaum einer Familie, mit normal hörenden Eltern und 2 betroffenen Kindern. Frauen
werden durch Kreise dargestellt. Männer werden durch Quadrate dargestellt. Das Symbol
+ steht für die normale DNA-Sequenz, das Symbol – für die Deletion. +/- zeigt eine
Person, die heterozygot ist und -/- zeigt eine Person, die homozygot für die c.35delG-Deletion
ist. Unterhalb des Stammbaums sind repräsentative Sanger-Sequenzierungsbilder mit
der heterozygoten und homozygoten Deletion dargestellt. Eine Visualisierung von c.35delG
mit Sequenzierung zeigt homozygote c und heterozygote d Deletionen. Die Deletion wird durch eine Lücke in der gelesenen Farbfolge dargestellt.
Diese Bilder wurden mit dem Integrative Genomics Viewer [1] von gnomAD visualisiert.
Abb. 11 Schema zur Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalyse mit Variantenfilterung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten
und Folgeschritten.
Abb. 12 2- und 3-dimensionale Darstellungen von Audiogrammen, erstellt mit AudioGene, einem
Programm zur Verarbeitung von Sequenzierdaten und Audiogrammen durch maschinelles
Lernen. Der Hörverlust durch die Gene a KCNQ4, b WFS1 und c COL11A2 manifestiert sich mit deutlich unterschiedlichen Audioprofilen. Bilder mit
Genehmigung von Smith RJ [96]
[97]
[98].
Die Variantenfilterung kann auf eine Teilmenge von Genen beschränkt werden, z. B.
auf diejenigen, die an autosomal-rezessiven oder autosomal-dominanten Hörverlust-Genen
beteiligt sind, wenn das familiäre Vererbungsmuster klar genug ist, um dies zu unterscheiden.
Ebenfalls von großem Interesse sind Varianten in und neben der kodierenden Sequenz,
sodass in der Regel ein Filter verwendet wird, um intronische Varianten zu entfernen,
die möglicherweise nicht von Interesse sind. Obwohl in den Vor- und Nachbearbeitungsschritten
bereits eine Reihe von Qualitätskontrollschritten durchgeführt werden, verbleiben
viele Varianten niedriger Qualität in den Daten, die durch die Anwendung von Qualitätsgrenzen
entfernt werden müssen.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Filterung gegen niedrige Allelfrequenzen (engl.:
minor allele frequencies; MAFs). MAFs werden berechnet als die relative Häufigkeit
des weniger häufigen (kleinen) Allels oder der Variante in den Allelen, die in einem
Pool von sequenzierten Individuen identifiziert wurden. Zum Beispiel identifiziert
eine bestimmte Population mit 50 Individuen eine Person mit einer heterozygoten Variante.
Fünfzig Personen haben jeweils 2 Allele, also insgesamt 100 Allele. Die MAF würde
wie folgt berechnet werden [1 Wechselalternatives Allel]/[100 Allele gesamt] für eine
Häufigkeit von 0,01 (1%) bei den getesteten Personen. Die Einstellung optimaler MAF-Schwellenwerte
ist wichtig, um häufige Varianten, die wahrscheinlich gutartig sind, deutlich zu reduzieren
[42] . Optimale MAF-Schwellenwerte für Hörverlust wurden in großen Kohorten aus mehreren
Labors evaluiert, die Expertenempfehlungen ermöglicht haben. MAF-Schwellenwerte werden
als ≤ 0,00007 (0,007%) für Varianten in autosomal-rezessiven Hörverlustgenen und≤0,00002
(0,002%) für Varianten in autosomal-dominanten Hörverlustgenen empfohlen [102].
Ein weiterer gängiger Filterparameter ist die Auswahl des Variantentyps. Durch die
Auswahl von nicht-synonymen Varianten („missense, splice, indel, stop gain und stop
loss, sowie start gain und start loss“) würden bspw. alle synonymen Varianten entfernt,
obwohl synonyme Varianten für die Beeinflussung der „Spleißlandschaft“ von Interesse
sein können, welche die Proteinfunktion stark beeinträchtigen könnte. Ein weiterer
Filterschritt besteht darin, jede Variante mithilfe verschiedener Pathogenitätsvorhersage-Tools
zu analysieren und zu dokumentieren, ob die Vorhersageergebnisse jede Variante als
pathogen oder gutartig bewerten. Während nicht jede Variante in gut untersuchten Genen
in klinisch orientierten Variantendatenbanken dokumentiert ist, werden diese Datenbanken
referenziert, um festzustellen, ob eine bestimmte Variante bereits bei einem Patienten
interpretiert wurde.
Auch die Konservierung von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wird berücksichtigt,
da Varianten, die hochkonservierte Nukleotide und Aminosäuren betreffen, a priori wahrscheinlich eher pathogen sind [103]. PhyloP-Scores messen durch den Vergleich mehrerer Arten den Grad der evolutionären
Konservierung in Nukleotiden, indem sie beurteilen, ob die Substitutionsraten langsamer
oder schneller als erwartet sind [104]. Die phyloP-Werte reichen von − 14 (nicht konserviert) bis 6,4 (hochkonserviert).
Grantham-Distanzen bewerten den evolutionären Abstand zwischen 2 Aminosäuren unter
Berücksichtigung der biochemischen und physikalischen Eigenschaften von Aminosäuren
und reichen von 0 bis zu einem maximalen Abstand von 215. Je weiter 2 Aminosäuren
voneinander entfernt sind, desto geringer ist deren „Austauschbarkeit“ und desto höher
ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Austausch von Aminosäuren pathogen ist [105]
[106].
Schließlich kann die Festlegung von vordefinierten „Allel-Balance“-Werten (Verhältnis
der Anzahl der Ablesungen mit der Variante zur Anzahl der Ablesungen mit der Referenzbasis)
je nach Vererbung Varianten zeigen, die homozygot oder heterozygot erscheinen. Es
wird erwartet, dass 50% der Ablesungen eine Variante zeigen würden, wenn eine heterozygote
Variante vorhanden ist, obwohl diese „Allel-Balance“ bei Ablesungen hoher Qualität
hohe Abweichungen aufweisen kann. Bei einer homozygoten Variante wird erwartet, dass
100% der Ablesungen die Variante zeigen. Die Sanger-Sequenzierung wird zur Validierung
von Varianten empfohlen, die „Allel-Balance“-Werte aufweisen, die von den akzeptierten
Grenzen (engl: „Cutoffs“) abweichen [49] .
Nachdem die Varianten im Rahmen der Anamnese des Patienten, durch Segregationstests
oder durch Test von zusätzlichen betroffenen oder nicht betroffenen Familienmitglieder
analysiert und erheblich reduziert worden sind, können Fehlinterpretationen von Varianten
vermieden werden.
9. Beispiel einer Variantenanalyse aus GJB2
9. Beispiel einer Variantenanalyse aus GJB2
Eine europäische Familie mit nicht betroffenen Eltern fragt genetische Tests für ihre
beiden Kinder an ([Abb. 10b]), die jeweils einen angeborenen, hochgradigen Hörverlust aufweisen. Das Vererbungsmuster
in dieser Familie scheint einem autosomal-rezessiven Muster zu folgen. Nach der genetischen
Untersuchung stellt sich heraus, dass die Kinder im Gen GJB2 im homozygoten Zustand eine einzige Nukleotiddeletion (c.35delG) haben, während ihre
Eltern beide heterozygot sind. Diese Deletion ist die häufigste Ursache für genetisch
bedingten Hörverlust in Europa. Die Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten zeigen, dass
die betroffenen Kinder homozygot sind, wobei 100% ihrer Ablesungen die Deletion zeigen
([Abb. 10c]). Die nicht betroffenen Eltern sind heterozygot, wobei etwa die Hälfte ihrer Ablesungen
die Deletion und die andere Hälfte die korrekte Sequenz zeigt ([Abb. 10d]). Die GJB2-Genexpression ist gut untersucht, sie ist in den Stützzellen und den Haarzellen des
vestibulären und cochleären Epithels während mehrerer Entwicklungsstadien der Maus
vorhanden. Obwohl dieses Gen und diese Variante gut charakterisiert sind, liefert
es ein gutes Beispiel dafür, wie wichtig es ist, Expertenrichtlinien für die Variantenfilterung
anzuwenden, um nicht einen potenziell signifikanten Befund zu übersehen, sondern auch
eine korrekte Assoziation zwischen Variante und Erkrankung zu gewährleisten.
[Tab. 3] zeigt eine Zusammenfassung der Informationen aus den verschiedenen Ressourcen, die
für die Variantenanalyse verwendet werden. GJB2 kodiert das gap-junction-beta-2-Gen, das am besten für nicht-syndromalen Hörverlust
(DFNB1A) bekannt ist, aber auch mit autosomal-dominantem nicht-syndromalem Hörverlust
(DFNA3A) assoziiert ist. Darüber hinaus ist GJB2 mit einer Reihe von autosomal-dominanten Syndromen wie dem Bart-Pumphrey-Syndrom,
dem Hystrix-like-Ichthyosis-Taubheits-Syndrom, dem Keratitis-Ichthyosis-Taubheits-Syndrom,
Keratoderma und Palmoplantar mit Taubheit und dem Vohwinkel-Syndrom verbunden. Es
gibt derzeit über 400 bekannte Varianten für das Gen GJB2, die in HGMD [43] dokumentiert sind, wobei das c.35delG die häufigste Variante bei nicht-syndromalen
Hörverlust ist. Diese Variante hat eine MAF von 0,002 (0,2%) bis 0,007 (0,7%), je
nach Datenbank. In der Literatur sind Trägerraten von bis zu 0,0189 (1,89%) in Europa
beschrieben [48]. Bei Einhaltung der Expertenempfehlungen zur Filterung einer autosomal-rezessiven
Erkrankung würde jede Variante mit einem MAF ≥ 0,00007 (0,007%) aus der Analyse entfernt,
wodurch auch diese wichtige Variante entfernt würde. Für die Entstehung der c.35delG-Deletion
wird ein sogenannter Gründereffekts (engl.: „founder effect“) vermutet. Hier stammt
die Variante von einer einzelnen Person, die sie an Nachkommen weitergegeben hat [107]. Viele Varianten von Hörverlust können als Gründermutationen klassifiziert werden,
die besonders hohe MAFs aufweisen können. Diese alten Varianten, die vor vielen tausend
Jahren entstanden sind, wurden durch Zeit und Raum getragen. Deshalb enthalten Analyserichtlinien
auch eine Liste von Genen, die MAF-Cutoff-Empfehlungen nicht einhalten. Auch GJB2 gehört zu den Genen, für die Ausnahmen gelten. Bei genauerer Betrachtung der „gnomAD“-Varianten
werden insgesamt 1 721 Varianten unter 275 002 Allelen (132 501 Individuen) mit Sequenzierungsdaten
zu dieser Position gemeldet. In dieser Datenbank sind auch 10 homozygote Patienten
erfasst, die keine schweren Kinderkrankheiten hatten und deren Verwandte ersten Grades
gesund waren. Da der Hörverlust durch die c.35delG-deletion sehr früh im Leben auftritt,
ist zu erwarten, dass diese Personen nicht in die Datenbank aufgenommen werden. Die
Entwickler der Datenbank weisen jedoch darauf hin, dass einige Personen mit schwerer
Erkrankung, die in einer geringeren Häufigkeit als in der Allgemeinbevölkerung [1] auftritt, fälschlicherweise in die Datenbank aufgenommen wurden. Dies ist eine wichtige
Erkenntnis, die bei der Verwendung verschiedener Allelfrequenz-Datenbanken zu beachten
ist. Sie eröffnet aber auch die Möglichkeit für mehrere Erklärungsversuche. Bei unvollständiger
Penetranz kann z. B. auch bei Normalhörenden eine Deletion nachgewiesen werden. Für
diese spezielle Variante ist dies unwahrscheinlich, wurde aber für 2 weitere Varianten
in GJB2 (p.Met34Thr und p.Val37Ile) [102] festgestellt. Es könnte auch bedeuten, dass ein Hörverlust bei diesen Personen nach
der Rekrutierung auftrat, was nicht rückverfolgbar ist.
Tab. 3 Ein Beispiel für eine abweichende Interpretation der homozygoten Deletion von GJB2 c.35delG.
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Datenbank
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Informationen
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GJB2-Informationen
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GeneCards
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Gap Junction Protein Beta 2; assoziiert mit Vohwinkel-Syndrom und Keratodermie, palmoplantar
mit Taubheit, sowie autosomal-dominant (DFNA3A) und autosomal-rezessiv (DFNB1A) Hörverlust.
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Hereditary Hearing Loss Homepage
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DFNA3A, DFNB1A
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OMIM
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Gap Junction Protein beta-2; beteiligt am Bart-Pumphrey-Syndrom, autosomal-dominant
(DFNA3A) und autosomal-rezessiv (DFNB1A) nicht-syndromaler Hörverlust, Hystrix-like-Ichthyosis-Taubheit-Syndrom,
Keratitis-ichthyosis-Taubheitssyndrom, Keratodermie und palmoplantar mit Taubheit
und Vohwinkel-Syndrom.
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Allelfrequenz Analyse der c.35delG-Variante
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dbSNP
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MAF=0,002; Klinische Bedeutung: pathogen
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GME
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Gesamtanzahl der Allele (Varianten): 5, keine homozygoten Individuen in 1.984 Allelen
(992 Individuen); MAF = 0,00252
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ExAC
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Gesamtanzahl der Allele (Varianten): 733, einschließlich 3 homozygoter Individuen
in 121.352 Allelen (60.676 Individuen); MAF=0,00604
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EVS
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Gesamtanzahl der Allele (Varianten): 93, keine homozygoten Individuen in 12.425 Allelen
(6.212 Individuen); MAF = 0,00748
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gnomAD
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Gesamtanzahl der Allele (Varianten): 1.721, darunter 10 homozygote Individuen in 275.002
Allelen (135.501 Individuen); MAF=0,006258
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Iranome
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Gesamtanzahl der Allele (Varianten): 3, keine homozygoten Individuen in 1.600 Allelen;
MAF = 0,00187575
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Klinisch orientierte Datenbanken zur Varianteninterpretation
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ClinVar
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Klinische Bedeutung: Pathogen von 26 Einsendern, keine Konflikte bei der Interpretation
der unterschiedlichen Pathogenität.
Bedingungen: Taubheit, autosomal-rezessiv 1A, verstümmelnde Keratodermie, Hystrix-like-Ichthyosis-Taubheit-Syndrom,
autosomal-dominante Keratitis-ichthyosis-Taubheitssyndrom, Keratodermie palmoplantärer
Taubheit, Knöchelpolster, Taubheit und Leukonychie-Syndrom, Taubheit, autosomal-dominant
3a, digene GJB2/GJB6 Taubheit, nicht-syndromaler Hörverlust und Taubheit, Hörverlust, bilateraler sensorineuraler
Hörverlust, bilateraler leitfähiger Hörverlust, schwerer sensorineuraler Hörverlust,
nicht-syndromaler Hörverlust, rezessiver, Taubheit
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The Connexin-deafness Homepage
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Autosomal-rezessive nicht-syndromale Taubheit
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DVD
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Pathogener, autosomal-rezessiver, nicht-syndromaler Hörverlust
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HGMD
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Taubheit, autosomal-rezessiv 1
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LOVD v. 3.0
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Pathogen
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In silico Pathogenitätsvorhersage Programme zur Variantenanalyse
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CADD
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Score: 24.9
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MutationTaster
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Krankheit verursachend
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PolyPhen-2
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Nicht bewertet
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SIFT
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Nicht bewertet
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Programme zur Vorhersage von Spleißvarianten
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Human Splicing Factor
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Kein signifikanter Effekt vorhergesagt
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GeneSplicer
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Kein signifikanter Effekt vorhergesagt
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MaxEntScan
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Kein signifikanter Effekt vorhergesagt
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NNSPLICE
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Kein signifikanter Effekt vorhergesagt
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Analyse Konservierung
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phyloP
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Nicht bewertet
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Grantham distance
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Nicht bewertet
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Genexpressions-Datenbanken
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gEAR Portal
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Exprimiert in P0 Maushaarzellen, P1 Haarzellen, Stützzellen und nicht-sensorischen
Zellen, E16.5 und P0 Maus cochleäres und vestibuläres sensorisches Epithel.
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SHIELD
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FACS-sortierte Haarzellen und Ganglienzellen: Expression in Utrikel und Cochlea embryonal
und postnatal (E12, E13, E16, P0, P6 und P15).
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Audiometrisches Profilierungswerkzeug
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AudioGene
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Gen nicht enthalten
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Die volle Position der GJB2 c.35delG Löschung ist Chr13(GRCh37):g. 20763686, NM_004004.5:c.35del, p.Gly12Valfs*2
Die klinisch orientierten Datenbanken wie „The Connexin-deafness Homepage“ [108], die DVD [42], HGMD [43], und LOVD v.3.0 [93] stimmen darin überein, dass diese Variante pathogen ist, mit einem möglichen Vorbehalt.
ClinVar zeigte 27 Einträge für diese Deletion. Elf spezifizierte autosomal-rezessive
nicht-syndromale Hörverluste und 11 weitere hatten Einträge mit der Auflistung „Hörschaden“
oder „nicht vorhanden“, was bedeutet, dass die Einsender keine Bedingung oder Vererbungsart
angegeben haben. Drei ClinVar-Zusender gaben an, dass diese Variante an einem autosomal-dominanten
Hörverlust beteiligt sei (Einreichungen: SCV000487402.1, SCV000700274.1 und SCV000536698.1).
In einem dieser Beiträge wurden mehrere autosomal-dominante syndromale Formen von
Hörverlust und autosomal-rezessivem nicht-syndromalem Hörverlust erwähnt (SCV000536698.1)
und ein anderer Antragsteller führte an, dass diese Variante mit autosomal-dominanten
Syndromen assoziiert sei. Ein letzter Eintrag listete diese Variante als an digener
Taubheit beteiligt auf (GJB2/GJB6) (SCV00000038810.5). Nach diesen Angaben wäre auch die Möglichkeit eines autosomal-dominanten
Hörverlustes bei den Trägereltern erhöht. Für den Laien können solche ClinVar-Einträge
Verwirrung in der Interpretation stiften.
Nur 2 der 4 beschriebenen Pathogenitätsvorhersage-Tools sind in der Lage, diese Deletion
zu bewerten. PolyPhen-2 und SIFT liefern Vorhersagen über Substitutionen. Der CADD-Score
[109] für diese Deletion beträgt 24,9, d. h. er liegt maximal bei etwa 0,5% der schädlichen
Variationen im menschlichen Genom. „MutationTaster“ hat diese Deletion als krankheitsverursachend
eingestuft. Es wird nicht vorhergesagt, dass die Spleißung durch diese Änderung signifikant
beeinträchtigt wird. Die Analyse der Konservierung des Nukleotids (phyloP) und der
Aminosäure (Grantham-Distanz) kann nur Substitutionen und nicht Deletionen beurteilen,
sodass diese nicht in der Lage sind, bei der Interpretation zu helfen.
Natürlich können Kliniker anhand von Literatur und klinischen Dokumenten über den
Zusammenhang der c.35delG-Deletion bei GJB2 mit Hörverlust die Kinder mit GJB2-assoziiertem Hörverlust und die Eltern als Träger sicher diagnostizieren, was für
Wiederholungsberechnungen bei erneutem Kinderwunsch hilfreich sein kann.
10. Vom Genom zum Phänom
Nach der außergewöhnlichen Leistung des Humangenomprojektes, die Referenzsequenz des
menschlichen Genoms zu liefern, ergaben sich viele Herausforderungen in Bezug auf
die effektive Anwendung dieses Wissens auf Erbkrankheiten. Die Kenntnis der „Anatomie“
des menschlichen Genoms kann keine direkte Aussage über die in den Genotypen kodierten
Phänotypen machen. Da jedoch ein Großteil der Theorie und Praxis der Medizin mit einem
Phänotyp beginnt, war es sinnvoll, das Wort „Phänom“ kurz nach der Beschreibung des Genoms einzuführen [110].
Die Phänomik erfasst den natürlichen Verlauf einer Krankheit und beschreibt das genaue
Spektrum der Krankheitssubtypen und -komplikationen sowie weitere phänotypische Informationen
[111]. Analog dazu zielt die Phänomik darauf ab, die gleichen zentralisierten, gut etablierten,
vernetzten und konsolidierten Strategien zur Beschreibung des natürlichen Verlaufs
aller Phänotypen, die die Genomik bereits für Annotationen, Methoden und Standards
für die genaue Beschreibung jedes genomischen Elements besitzt, zur Verfügung zu stellen
[112]. Die effektive Umsetzung von phänombasierten Forschungsansätzen erfordert neue Informatik-
und Datenanalysestrategien [113]. Die Entwicklung der „Human Phenotype Ontology“ (HPO) Datenbank bietet eine standardisierte
Terminologie phänotypischer Anomalien zur Rationalisierung der „phänotypischen“ Differenzialdiagnostik
[114]. Die HPO hat derzeit über 13 000 Begriffe und über 156 000 Einträge zu Erbkrankheiten
und hat sich als leistungsfähiges Werkzeug zur Verbesserung der Exom- und Genomanalyse
erwiesen. Durch die Integration von HPO-Terminologie, die eine rationalisierte „tiefe
Phänotypisierung“ (engl.: deep phenotyping) von Patienten ermöglichte, konnten im
NIH „Undiagnosed Disease Program“ und im „Undiagnosed Diseases Network“ die molekulare
Diagnose verbessert werden. Die erneute Analyse von Exom-Sequenzierungsdaten von bisher
„nicht diagnostizierbaren“ Patienten hatte die diagnostische Lösung von zusätzlichen
10–20% der Patienten zur Folge [115]
[116]. Die HPO-Datenbank enthält derzeit über 1 600 Ergebnisse mit dem Wort „Hörverlust“.
Eine spezifische Terminologie könnte die Liste der genetischen Erkrankungen mit Hörverlust
schnell von 1 600 auf mehrere Dutzend eingrenzen. Die Kenntnis des gesamten Phänotyps
versehen mit einer optimierten Terminologie kann die Genomanalyse erheblich erleichtern.
HPO-Begriffe werden derzeit in Bioinformatik-Pipelines der Hochdurchsatz-Sequenzierung
integriert, um die Analysegeschwindigkeit bei Patienten mit pathogenen Varianten in
bereits identifizierten und charakterisierten Genen deutlich zu erhöhen.
Hörverlust hat die besondere Herausforderung einer ausgeprägten klinischen Heterogenität
des Phänotyps. Auch bei Personen in der gleichen Familie, die die gleiche Variante
segregieren, kann ein heterogener Phänotyp die genaue Charakterisierung des Hörverlusts
erschweren. Durch die Untersuchung einer großen Anzahl von Patienten mit Hörverlust
mit pathogenen Varianten im gleichen Gen konnten mehrere Gene identifiziert werden,
die robuste Assoziationen aufweisen. Dies wurde insbesondere bei autosomal-dominantem
Hörverlust untersucht und hat zur Entwicklung eines Tools „AudioGene“ geführt [96]
[98]. Dieses auf „machine learning“ basierende Programm analysiert audiologische Profile
von Patienten mittels eines computergestützten Clustering-Algorithmus und priorisiert
die wahrscheinlichsten Gene für autosomal-dominanten Hörverlust für das Mutationsscreening.
Beim Vergleich der prädiktiven Leistung von „AudioGene“ mit einer Expertengruppe,
die die wahrscheinlichsten autosomal-dominanten Gene auflistet, die an Patienten mit
verfügbaren Audiogrammdaten beteiligt sein könnten, übertraf „AudioGene“ die Expertengenvorhersage
um 33% [96]. Die Weiterentwicklung von „AudioGene“ fügt dem Audioprofil nun eine dritte Dimension
hinzu: das Alter [98]. Dieses zusätzliche Merkmal ist von klinischer Bedeutung für den autosomal-dominanten
Hörverlust, da die meisten Formen des dominanten Hörverlustes progressiv sind. Das
Alter wird leicht durch Farbe auf einer 3-dimensionalen Oberfläche visualisiert.
Die drei in [Abb. 12] gezeigten Beispiele zeigen die zwei- und dreidimensionale Darstellung der Gene KCNQ4 (DFNA2A), WFS1 (DFNA6/14/38) und COL11A2 (DFNA13). Die AudioGene Profile in 2- und 3-dimensionalen Formen des Gens KCNQ4 zeigen einen charakteristisch progressiven, hochfrequenten Hörverlust ([Abb. 12a]). Vergleicht man dies mit den Audioprofilen für die Gene WFS1 mit progressivem, niederfrequentem Hörverlust ([Abb. 12b]) und COL11A2 mit relativ stabilem Mittelfrequenz- und progressivem, hochfrequentem Hörverlust
([Abb. 12c]), kann man sich vorstellen, wie stark dies für die Vorhersage der zugrundeliegenden
genetischen Faktoren sein kann, die bei einer genetisch heterogenen Erkrankung wie
Hörverlust hilfreich sind. Dieses Tool bietet eine diagnostische Strategie zur Unterstützung
genauer genetischer Tests und ist ein Beispiel für die Verknüpfung von audiologischen
„big data“ mit der Genetik.
11. Die Perspektiven der Hochdurchsatz-Sequenzierung
11. Die Perspektiven der Hochdurchsatz-Sequenzierung
„Big data“ hat das Gebiet der Diagnostik genetischer Schwerhörigkeit revolutioniert.
Moderne Sequenzierverfahren haben das Potenzial, wichtige medizinische Diagnosen zu
entschlüsseln, und so die Patientenversorgung erheblich zu beeinflussen und die personalisierte
Medizin zu unterstützen. Das Feld zeichnet sich aktuell durch ständige große Fortschritte
aus und nicht jede Variante in unserem Genom ist derzeit bekannt und wird richtig
verstanden. Die Aussage von Cynthia C. Mortons American Society of Human Genetics
Presidential Address im Jahr 2014 betonte, dass wir uns im gegenwärtigen Zustand der
Genetik gerade an einem besonderen Punkt befinden: „we find ourselves building the
plane as we are flying it“ [117]. Es ist einfach die Unsicherheiten des Gebiets von „big data“ als Zeichen zu interpretieren,
dass das Gebiet wenig Nutzbares zu bieten hat. Aber die Wahrheit ist, dass die Genomik
wahrscheinlich eine immer größere Rolle in der Patientenversorgung spielen wird. Eines
Tages werden wir hoffentlich in der Lage sein, fast alle Patienten auf molekulargenetischer
Grundlage zu diagnostizieren, sogar solche mit höchst-seltenen genetischen Störungen.
Es ist schwer vorauszusehen, ob in der Zukunft jedes Neugeborene bei der Geburt einem
genetischen Screening unterzogen wird, um Betroffene zu identifizieren, bevor die
Symptome auftreten. Das Screening kann von gezielten Gen-Panels bis hin zur Genomsequenzierung
reichen, um die falsch-positive-Rate zu reduzieren, die z. B. beim Stoffwechsel- und
Hörscreening von Neugeborenen auftreten kann. Die Befürworter der Genomik sehen in
dieser Technologie ein großes Potenzial, das die Voraussetzungen für eine lebenslange
personalisierte medizinische Versorgung schafft. Dies könnte zusätzliche Informationen
bei gefährdeten Personen unter bestimmten Bedingungen bieten. Eine rigorose Erforschung
der medizinischen und ethischen Implikationen wird hoffentlich die vorteilhaftesten
Wege aufzeigen und gleichzeitig die Wünsche und Rechte der Patienten respektieren.
Die genetische Landschaft des Hörverlustes ist noch lange nicht vollständig charakterisiert
und für jede „Bekannte“ scheint es eine lange Liste von „Unbekannten“ zu geben. Patienten,
profitieren von der molekulargenetischen Diagnose, gewonnen aus der massenhaften Zusammenführung
multidisziplinärer großer Datenmengen. Patienten ohne genetische Diagnose trotz genetischer
Diagnostik können in der Zukunft die genetische Untersuchung wiederholen. Mit der
Weiterentwicklung der Genomdaten und „big data“ Methoden können zunehmend Gene identifiziert
und charakterisiert werden. Eines Tages kann es dadurch möglich sein, dass jeder Betroffene
routinemäßig seine genetische Diagnose erhält.
Eine genetische Untersuchung in Form einer Gen-Diagnostik sollte nach Anamnese, körperlicher
Untersuchung und audiologischer Untersuchung für die Diagnose einer Schwerhörigkeit
erfolgen. Eine Gen-Diagnostik kann nachfolgende diagnostische Verfahren, die invasiv
sein könnten, vermeiden. Die Gen-Diagnostik erlaubt es, den Patienten und seine Familie
bezüglich Therapieoptionen und Familienplanung zu beraten. Diese bilden die Grundlage
für die Entwicklung einer personalisierten Medizin und in Zukunft einer möglicherweise
maßgeschneiderten Pharmakotherapie oder einer individuellen molekularen Therapie.
