Betulinic acid: a new chemotherapeutic agent in the treatment of neuroectodermal tumors

Abstract

We identified betulinic acid (BetA) as a new cytotoxic agent active against neuroectodermal tumor cells including neuroblastoma, medulloblastoma, glioblastoma and Ewing's sarcoma cells representing the most common solid tumors of childhood. BetA induced apoptosis independent of wild-type p53 protein and accumulation of death inducing ligand/receptor systems such as CD95. BetA had a direct effect on mitochondria resulting in the release of soluble apoptogenic factors such as cytochrome c or AIF from mitochondria into the cytosol where they induced activation of caspases. Over expression of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 or Bcl-X_L that blocked loss of the mitochondrial membrane potential and cytochrome c release from mitochondria conferred resistance to BetA at the level of mitochondrial dysfunction, protease activation and nuclear fragmentation. Neuroblastoma cells resistant to CD95- or doxorubicin-triggered apoptosis remained sensitive to treatment with BetA suggesting that BetA may bypass some forms of resistance. Moreover, BetA exhibited potent antitumor activity on primary tumor cell cultures from all neuroblastoma (4/4), all medulloblastoma (4/4) and most glioblastoma patients (20/24) ex vivo. These findings suggest that BetA may be a promising new agent in the treatment of neuroectodermal tumors in vivo.

Abbreviations: AIF, apoptosis inducing factor; BetA, betulinic acid; DiOC₆(3), 3,3'-dihexyloxacarbocyanide iodide; DTT, Dithiothreitol; ECL, enhanced chemiluminescence; FACS, fluorescence-activated cell-sorting; ICE, interleukin 1β-converting enzyme; ΔY_m mitochondrial transmembrane potential; PARP, poly(ADP-ribose) polymerase; zVAD.fmk, benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone.

Zusammenfassung

Wir identifizierten Betulinsäure als ein neues Chemotherapeutikum wirksam gegen neuroektodermale Tumorzellen wie Neuroblastom-, Medulloblastom-, Glioblastom- oder Ewing-Sarkomzellen, die häufigsten soliden Tumoren des Kindesalters. Betulinsäure induziert Apoptose unabhängig von wild-Typ p53 Akkumulation und unabhängig von Todesrezeptor/Liganden Systemen wie dem CD95-System. Betulinsäure übt einen direkten Effekt auf Mitochondrien aus, was zur Freisetzung von löslichen apoptogenen Faktoren wie Cytochrome c oder AIF aus den Mitochondrien ins Zytosol und zur Aktivierung von Caspasen führt. Überexpression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 oder Bcl-X_L, die einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien blockieren, führt zur Resistenz auf der Ebene der Mitochondriendysfunktion, Caspasenaktivierung und nukleären Fragmentierung. Neuroblastomzellen, die resistent sind gegenüber CD95- oder Doxorubicin-vermittelter Apoptose, bleiben sensitiv gegenüber einer Behandlung mit Betulinsäure, was darauf hinweist, daß Betulinsäure einige Resistenzformen überkommen kann. Weiter ist Betulinsäure wirksam bei Primärzellkulturen von allen Neuroblastom- (4/4), allen Medulloblastom- (4/4) und den meisten Glioblastom-Patienten (20/24) ex vivo. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Betulinsäure eine vielversprechende neue Substanz ist in der Behandlung von neuroektodermalen Tumoren in vivo.

Key words

apoptosis - cytotoxic drugs - betulinic acid - mitochondria

Schlüsselwörter

Apoptose - Zytostatika - Betulinsäure - Mitochondrien