Quantitative Evaluierung von Lymphknotenmikrometastasen in einem orthotopen Mammakarzinom-Xenotransplantationsmodell mittels real-time PCR human spezifischer ALU-Sequenzen

Die Metastasierung von Mammakarzinomzellen in die regionären Lymphknoten ist nicht nur entscheidend für die Prognose der Erkrankung, sondern bildet auch die wesentliche Grundlage zur Festlegung der weiteren Lokal- und Systemtherapie. Die Mechanismen der lymphogenen Metastasierung sind allerdings weitgehend ungeklärt. Entsprechende wissenschaftliche Untersuchungen machen dafür die Etablierung eines standardisierten Metastasierungsassays notwendig. Hier beschreiben wir eine sensitive Methode zur frühzeitigen Detektion und quantitativen Bestimmung von Lymphknotenmetastasen in einem Nacktmausmodell unter Verwendung von MDA-MB-435 Brustkrebszellen, die nach orthotoper Xenotransplantation spontan in die Lymphknoten und Lunge metastasieren. Es wurden 1×10⁶ MDA-MB-435 Zellen in die Brustdrüse injiziert. Nach einem Zeitpunkt von jeweils 2 und 5 Wochen wurden den Mäusen die axillären Lymphknoten entnommen, um daraus die genomische DNA zu extrahieren. Die DNA wurde verwendet, um anhand einer quantitativen real-time PCR den Anteil von human spezifischen ALU-Sequenzen in muriner DNA zu bestimmen. Es wurde die Taqman-PCR Methode genutzt. Die Messung erfolgte mittels einer Standardverdünnungsreihe von humaner DNA, gewonnen aus MDA-MD-435 Mammakarzinomzellen, in muriner DNA, gewonnen aus Lymphknoten von Wildtyp-Mäusen. Die Methode lieferte eine reproduzierbare Bestimmung des Anteils humaner DNA in muriner DNA bis in den Bereich von 0,0001%. Bereits zwei Wochen nach Tumorzellinokkuklation konnten wir mit dieser Methode disseminierte humane Brustkrebszellen in den Lymphknoten nachweisen. Der Anteil von humaner DNA zu muriner DNA in den Lymphknoten betrug in unserem Experiment zu diesem Zeitpunkt 0,41%. Dieser Prozentsatz ist mit den Werten anderer Metastasierungsassays aus der Literatur gut vergleichbar. Nach 5 Wochen stieg der Anteil von humaner zu muriner DNA nur diskret an und betrug 0,46%. Mit diesem Metastasierungsassay konnte gezeigt werden, dass es zwar zur frühzeitigen Tumorzellausbreitung in die Lymphknoten kommt, dies jedoch, trotz Tumorwachstums in der Brust, nicht mit einem gleichzeitigen Wachstum dieser Lymphknotenmikrometastasen einhergeht. Zusammenfassend liefert diese Methode eine zuverlässige Möglichkeit zur Detektion und zur exakten Quantifizierung von Mikrometastasen in Lymphknoten.