Aufklärung der Glucokinaseregulation in der Leber durch sensitive fluoreszenzmikroskopische Methoden

Fragestellung: Die Glucokinase (GK) ist ein wichtiger Regulator des Glucosestoffwechsels in der Leber. Sie wird in Abhängigkeit von Fructose-1-phosphat und Fructose-6-phosphat durch ein spezifisches Glucokinase Regulatorprotein (GRP) kompetitiv gehemmt. Das GRP vermittelt zudem einen glucoseabhängigen Translokationsprozess der GK zwischen Zytoplasma und Nukleus. Da bislang weder die Kristallstruktur des GRP aufgeklärt, noch die Interaktion zwischen der GK und dem GRP in vivo direkt detektiert werden konnte, ist der Mechanismus des GK-Translokationsprozesses noch wenig verstanden. Allerdings ist es gelungen, ein Aminosäuremotiv zu ermittelt, welches die Bindung an die GK vermittelt.

Es sollte daher untersucht werden, ob es mittels sensitiver fluoreszenzmikroskopischer Methoden möglich ist, die GK-GRP Interaktion in vivo zu detektieren.

Methodik: Die GK wurde in Form eines ECFP-Fusionskonstrukts (ECFP-GK) und das GRP sowie eine nicht an die GK bindende Mutante des GRP als EYFP-Fusionskonstrukt (EYFP-GRP) in COS-1 Zellen transfiziert. Der Fluorescence Resonance Energy Transfer von ECFP auf EYFP wurde mittels der sensitized emission Methode (FRETN) bestimmt.

Ergebnisse: COS-1 Zellen exprimieren endogen weder die GK noch das GRP. ECFP-GK war in transfizierten COS-1-Zellen bei 5mmol/l Glucose nur in Gegenwart von EYFP-GRP im Nukleus lokalisiert, nicht aber nach Cotransfektion mit der EYFP-GRP Mutante. FRETN war im Cytoplasma von ECFP-GK und EYFP-GRP transfizierten COS-1-Zellen bei 5mmol/l Glucose signifikant höher (p<0,05) als bei 25mmol/l Glucose. Eine durch die Fluoreszenzproteine selbst vermittelte Interaktion konnte ausgeschlossen werden. Beide Werte lagen signifikant höher als die der nur mit ECFP und EYFP-GRP transfizierten COS-1-Zellen bei der gleichen Glucosekonzentration (p<0,01 bei 25mmol/l Glucose und p<0,001 bei 5mmol/l Glucose).

Schlussfolgerung: Durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ist es somit erstmals gelungen, die Interaktion zwischen der GK und dem GRP in vivo nachzuweisen und damit neue Aspekte der posttranslationalen GK-Regulation in der Leber aufzuzeigen. Damit eröffnen sich neue Perspektiven für eine spezifische pharmakotherapeutische Modulation der GK-Enzymaktivität in der Leber.