Nope als Oberflächenmarker fetaler Leberstammzellen der Maus

Einleitung: In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass fetale Leberstammzellen an Tag 12.5 der Embryonalentwicklung (ED 12.5) eine homogene Zellpopulation Albumin+/Afp+/Pancytokeratin+/Sca1+ Hepatoblasten darstellen, die über die Oberflächenmarker E-cadherin, Liv2 oder Dlk aufgereinigt werden können und nach Transplantation eine hohe Repopulationskapazität der Leber zeigen (Nierhoff et al.). Diese aufgereinigten Leberstammzellen konnten wir in einer cDNA Microarray Analyse weiter charakterisieren. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung von Neighbor of Punc E11 (Nope) als neuem Oberflächenmarker fetaler Leberstammzellen während der Leberentwicklung der Maus.

Methoden: Wir isolierten fetale Lebern zeitlich-gepaarter Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten der Leberentwicklung (ED 11.5 bis adulte Leber). RNA und Protein (Gesamt- oder Membranprotein) wurden extrahiert und quantitative RT-PCR sowie Western Blot wurden durchgeführt für Nope, Afp and E-cadherin. Immunhistochemische Färbungen sowie FACS Analysen nach Präparation als Einzelzellsuspension wurden als Doppelfärbung durchgeführt in Kombination von Nope mit epithelialen Markerproteinen (Afp, Albumin, E-cadherin oder Liv2).

Results: Die quantitative RT-PCR zeigte eine höhere Expression von Nope in Hepatoblasten im Vergleich mit adulter Leber und bestätigte somit unsere Microarray-Daten. Im Western Blot war Afp positiv in der fetalen und negativ in der adulten Leber. E-cadherin als Oberflächenmarker zeigte eine stärkere Bande in der Membran- als in der Gesamtproteinfraktion. Nope war nur in der Membranfraktion fetaler Leberzellen nachzuweisen. Die Gesamtproteinfraktion sowie Proteinextraktionen der adulten Leber waren negativ für Nope. Immunozyto- and Immunohistochemie zeigten die spezifische Koexpression von Nope mit Albumin, Afp, Liv2 and E-cadherin. FACS Analysen bestätigten die Expression von Nope auf der Oberfläche E-cadherin- und Liv2-positiver Hepatoblasten.

Discussion: Nope ist ein membranständiges Protein, welches innerhalb der fetalen Leber spezifisch auf der Oberfläche von Hepatoblasten exprimiert wird, jedoch nicht mehr in der adulten Leber. Nope ist bisher als axonaler guidance receptor vorbeschrieben, eine Expression in endodermalem Gewebe war unbekannt. Weitere Studien zum Einsatz von Nope als Marker für fetale und adulte Leberstammzellen sowie zur funktionellen Bedeutung von Nope in der Leberentwicklung sind geplant.

Literatur: [1] Nierhoff D, Ogawa A, Oertel M, Chen YQ, and Shafritz DA.Purification and characterization of mouse fetal liver epithelial cells with high in vivo repopulation capacity. Hepatology 2005;42:130-139.