Quantitative p53-Proteinbestimmung in benignen Mammageweben, Mammakarzinomen und axillären Lymphknotenmetastasen

Zusammenfassung

Die meisten Studien über die prognostische Wertigkeit der p53-Expression bei Mammakarzinomen beruhten bislang auf immunhistochemischen Methoden und führten zu sehr widersprüchlichen Ergebnissen. Hauptursache hierfür dürfte die subjektive Beurteilung der Färbeintensität des Gewebes und daher willkürliche Festlegung eines Schwellenwertes zur Trennung „p53-positiver“ von „p53-negativen“ Proben sein. Dieser subjektive Einfluß des Untersuchers wäre durch einen quantitativen p53-Proteinassay vermeidbar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein luminometrischer Assay zur Quantifizierung der p53-Proteinkonzentrationen in Mammakar-zinomgeweben (n = 99) verwendet. Gewebeaufbereitung und Zytosolherstellung stimmten mit dem Verfahren des Abbott-Steroidrezeptorassays überein. Zur Definition einer oberen Normgrenze (Cut-Off) wurden Gewebeproben aus normalem oder benigne alteriertem Mammaparenchym (n = 40) analysiert. Zusätzlich wurden histologisch normale (n = 6) und metastatisch befallene axilläre Lymphknoten (n = 8) untersucht. Durch Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im Zytosol mit der Bio-Rad-Methode konnten die p53-Proteinkonzen-trationen - analog zum Rezeptorassay - in ng/mg Protein ausgedrückt werden. In den Kontrollgeweben fand sich eine breite Streuung der p53-Konzentrationen (= 0,01-0,76 ng/mg Protein, Median: 0,035 ng/mg Protein) mit einer oberen 5%-Vertrauensgrenze von 0,111 ng/mg Protein, welche als obere Normgrenze (Cut-Off) verwendet wurde. Bei qualitativer Betrachtung zeigten 66% (65/99) der invasiven Mammakarzinome sowie 5 von 8 Lymphknotenmetastasen erhöhte p53-Konzentrationen. Die relative Häufigkeit erhöhter p53-Konzentrationen zeigte eine signifikante Beziehung zum histologischen Grading der Karzinome (Gl: 36%; GII: 72%; GIII; 78%), nicht hingegen zum Nodal- oder Rezeptorstatus. Demgegenüber ergab der quantitative Vergleich der p53-Konzentrationen einen deutlichen Informationsgewinn: Die Gesamtgruppe der invasiven Karzinome zeigte signifikant höhere p53-Konzentrationen als die Kontrollgruppe (p<0.0003). In nodal-positiven und rezeptornegativen Karzinomen waren die Konzentrationen jeweils tendenziell höher als in nodal-negativen und rezeptorpositiven Tumoren, wenngleich diese Unterschiede nicht signifikant waren. Mit steigendem histologischen Malignitätsgrad fand sich ein massiver Anstieg der p53-Konzentrationen, wobei alle Unterschiede zwischen den Untergruppen Gl, GII und CIII signifikant waren (p = 0.0066-p = 0.0384). Zusammenfassend weisen Mammakarzinome höheren histologischen Malignitätsgrades deutlich höhere p53-Proteinkonzentrationen auf als Tumoren geringerer Malignität. Bei Mammakarzinomen scheint die Rate erhöhter p53-Proteinkonzentrationen deutlich höher zu sein als die von anderen Autoren berichtete Mutationsfrequenz der proteincodierenden Regionen des p53-Gens.

Abstract

Most of the previous studies on the prognostic significance of p53 expression in breast Cancers were based on immunohistochemical methods and gave contradictory results. This problem might be due to subjective evaluation of tissue staining and arbitrary definition of a threshold to separate „p53 positive“ from „p53 negative“ samples. The investigator's influence could be avoided by quantitative determination of p53 protein concentrations. In this study, a luminometric assay was used to measure p53 protein concentrations in breast Cancer tissues (n = 99). Preparation of tissue samples and cytosols was identical to that used in the Abbott Steroid receptor assay. To define an upper normal limit (cut off), samples from healthy or benign parenchymal tissues (n = 40) were analysed. In addition, histologically normal lymph nodes (n = 6) and axillary lymph node metastases (n = 8) were examined. Determination of total protein concentrations in cytosols allowed for the p53 protein concentrations to be given in ng/mg protein - similar to the receptor assay procedure. In control tissues, a wide range of p53 concentrations (= 0.01 -0.76 ng/mg protein, median: 0.035 ng/mg protein) was found. The upper 5%-confidence limit of 0.111 ng/mg protein was used as upper normal limit (cut off). When data were qualitatively evaluated, 66% of invasive carcinomas (65/99) and 5 of 8 lymph node metastases showed elevated p53 concentrations. The relative frequency of elevated p53 concentrations demonstrated a significant relationship to the histological grading of carcinomas (Gl: 36%; GII: 72%; GIII: 78%), but not to the nodal or receptor Status. However, more information could be obtained from quantitative comparison of p53 concentrations: The total group of invasive carcinomas demonstrated significantly higher p53 concentrations than the controls (p<0.0003). In nodal positive and receptor negative carcinomas concentrations were somewhat higher than in nodal negative and receptor positive tumours, respectively, although these differences were not significant. The degree of histological malignancy was positively related to an increase in p53 concentrations. All differences between the subgroups Gl, GII and GIII were significant (p = 0.0066 to p = 0.0384). In summary, breast carcinomas of higher histological degrees of malignancy demonstrated higher concentrations of p53 protein than tumours of relatively low grade of malignancy. In breast Cancers, the rate of elevated p53 protein concentrations seems to exceed the frequency of mutations in the protein-coding regions of the p53 gene.