Einleitung: Keratine sind obligate Heteropolymere aus einem Typ I (K9-K20) und einem Typ II (K1-K8) Keratin und bestimmen als Intermediärfilamente entscheidend die mechanischen Eigenschaften von Zellen. Keratine werden gewebs- und zell-spezifisch exprimiert. In einfachen Epithelien (z.B. Tumoren) findet man vor allem K8/K18. SPC ist ein bioaktives Lipid, das an vielen biologischen Prozessen beteiligt ist (Proliferation, Zellmigration, Wundheilung). Wir konnten zeigen, dass SPC in humanen Pankreaskarzinomzellen das Keratin-Zytoskelett reorganisiert, was mit einer Veränderung der elastischen Eigenschaften der Zellen einhergeht. SPC induziert ferner die Phosphorylierung von Keratinen an spezifischen Serinen. Hier untersuchten wir, inwieweit die Phosphorylierung von K8 an Ser431 und K18 an Ser52 durch SPC die Organisation des Keratin-Zytoskeletts in Pankreaskarzinomzellen beeinflusst.
Methoden: Für Western Blots und Immunocytochemie wurden Antikörper gegen Keratin und phosphospezifische Antikörper gegen Phospho-Keratin eingesetzt. Für die Transfektionsexperimente wurden K8-eCFP und K18-eYFP cDNA Plasmide verwendet. Keratinmutanten (K8-S431-A, K8-S431-E, K18-S52-A, K18-S52-E) wurden mithilfe des QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) erzeugt.
Ergebnisse: Wir können zeigen, dass SPC eine spezifische Phosphorylierung von K8/K18 an den Phosphorylierungsstellen K8-Ser431 und K18-Ser52 zeitabhängig induziert. Bei Koexpression von K8-S431-E mit Wildtyp K18 oder Wildtyp K8 mit K18-S52-E konnte keine Veränderung der Keratinorganisation gegenüber den reinen Wildtyp-konstrukten beobachtet werden. Bei Koexpression beider S/E Keratinmutanten zeigte sich jedoch eine deutliche perinukleäre Organisation des transfizierten Keratins. Diese Organisationsform ähnelt stark der Reorganisation von endogenem Keratin und transfiziertem Wildtypkeratin nach Behandlung von Pankreaskarzinomzellen mit SPC. Dagegen vermochte SPC die Organisation von transfiziertem K8-S431-A/K18-S52-A nicht zu beeinflussen.
Diskussion: Die Phosphorylierung von K8/K18 an den Phosphorylierungsstellen K8-Ser431 und K18-Ser52 stellt somit eine notwendige und ausreichende posttranslationale Modifikation für die Reorganisation des Keratins in humanen epithelialen Tumorzellen dar.
