Glycochenodeoxycholsäure induziert Apoptose in humanen Hepatomzelllinien über Fas/CD95- und Caspase 8-unabhängige Mechanismen

Einleitung: Die quantitativ bedeutendste hydrophobe Gallensäure des Menschen, Glycochenodeoxycholsäure (GCDCA), induziert in Hepatozyten in moderaten mikromolaren Konzentrationen Apoptose. GCDCA aktiviert in vitro den Todesrezeptor Fas/CD95; dies führt über die Bildung des „death-inducing signaling complex“ (DISC) zur Aktivierung der Caspase 8. In zellfreien Systemen können hydrophobe Gallensäuren jedoch auch direkt über eine mitochondriale Schädigung Cytochrom C freisetzen, das über eine Aktivierung der Caspase 9 Apoptose induziert. Das Ziel dieser Studie war daher, die Rolle von (i) Fas/CD95 und (ii) Caspase 8 für die GCDCA-induzierte Apoptose in menschlichen Hepatomzelllinien zu untersuchen.

Methodik: Humane Fas-haltige HepG2-Zellen und Fas-defiziente Hep3B- und HuH7- Zellen wurden stabil mit dem Gallensäurentransporter Ntcp transfiziert. Caspase 8 wurde durch spezifische “small interfering RNA“ (siRNA) transkriptionell herunterreguliert. Die Aktivität der Caspase 8 wurde durch den Inhibitor Z-IETD-FMK unterdrückt. Die Expression und Aktivierung der Caspasen 3, 7, 8 und 9 wurden mittels Immunoblot bestimmt. Apoptose wurde zudem über eine Messung der Caspase 3/7- Aktivität unter Verwendung des fluoreszierenden Substrats Z-DEVD-R110 quantifiziert.

Ergebnisse: GCDCA (75 mM, 4h) induzierte sowohl in Fas-haltigen HepG2-Ntcp als auch in Fas-defizienten Hep3B-Ntcp und HuH7-Ntcp Hepatomzellen Apoptose. Caspase 8 wurde durch synthetische Caspase 8 siRNA (10 nM) 24–72h nach Transfektion in HepG2-Ntcp Zellen fast vollständig herunterreguliert. In diesen Caspase 8-defizienten Zellen wurde die GCDCA-induzierte Apoptose nur um 26% reduziert. Im Gegensatz dazu wurde die durch TNFα (50 ng/ml) und Actinomycin D (0.2µg/ml) induzierte Apoptose im gleichen experimentellen System um 79% reduziert. Die aktivierten Caspasen 3, 7 und 9 waren in Caspase 8-defizienten Zellen nach Stimulation mit GCDCA gleichermaßen deutlich nachweisbar, nicht jedoch nach Stimulation mit TNFα/Actinomycin D. Der Caspase 8-Inhibitor Z-IETD-FMK (20µM) reduzierte in HepG2-Ntcp nur die durch TNFα/Actinomycin D, nicht aber die durch GCDCA induzierte Apoptose.

Schlussfolgerung: GCDCA induziert in humanen Hepatomzelllinien Apoptose vorwiegend über Fas/CD95- und Caspase 8-unabhängige Mechanismen.