Metabolic Profiling mit NMR und MS: Screening aus Urin auf metabolische Imbalance

Einleitung: Viele Stoffwechselkrankheiten können durch unterschiedliche Verfahren (GC, MS, Immunoassay u.a.) nachgewiesen werden. Eine neue, alternative Möglichkeit bietet das Metabolic Profiling, eine Kombination aus spektroskopischen (NMR- und Massenspektroskopie) und statistschen Verfahren, bei der nach Veränderungen im „Metabolitenpool“ gesucht wird. Da Stoffwechselkrankheiten vergleichsweise selten sind, wurden für die Validierung der Methode Urine von behandelten Neugeborenen verwendet, in der Annahme, dass Medikamente und ihre Metaboliten sich ähnlich nachweisen lassen, wie die Produkte von Stoffwechseldefekten.

Material und Methode: Es wurde Urin von 184 Neu- und Frühgeborenen im postkonzeptionellen Alter von 24–41 Wochen untersucht, der zwischen dem 3. und 31. LT gesammelt wurde. Die Proben wurden in einer Doppelblindstudie durch einen Metabolic Profiler (Fa. Bruker, 600MHz-NMR Spektrometer und einem microTOF-LC-MS) gemessen. Beide Datensätze wurden über Statistikmodule (NMR: AMIX, MS: Profile Analysis) durch Principal Component Analyse (PCA) bewertet. Die PCA visualisiert dabei Varianzen eines gegebenen Probensatzes. Dabei zeigen Gruppen von Proben im Scores-Plot gleiche Eigenschaften, während im Loadings-Plot Rückschlüsse auf Ursache der Unterschiede sichtbar werden. Ausreißer können von der normalen Verteilung durch krankheitsbedingte Gründe, Medikamente oder Ernährung verursacht werden.

NMR: Zur Auswertung wurde das vollständige 1H-NMR-Spektrum mit Ausnahme des Wasserbereichs verwendet. In der NMR PCA (PC1/PC2) können mehrere Gruppen unterschieden werden. Besonders deutlich fallen im Scores-Plot zwei große Gruppen auf, deren Varianz im Loadings-Plot dem aromatischen Bereich (7,5 ppm) zugeordnet werden kann.

MS: Für die Analyse wurden die Rohdaten im Bereich von 50–600 m/z und 0,3–9min verwendet, die im Negativ- und Positiv-Mode gewonnen wurden. Ebenso wie in der NMR-PCA fallen auch hier zwei große Gruppen (121 und 63 Kinder) im Scores-Plot von PC1/PC2 auf, die sich im Loadings-Plot in den Massen 348 m/z bei 290s im Negative-Mode (350 m/z bei 290s im Positv-Mode) unterscheidet.

Ergebnis: Die gefundene Molekularmasse der Verbindung von 348,11g/mol legt die Summenformel C16H19N3O4S nahe, die nach einer Datenbankrecherche den Verbindungen Ampicillin, Cephadrine oder Penicillin T entsprechen. Die Interpretation der NMR-Daten im Aromatenbereich (7,5 ppm) schließt Cephadrin und Penicillin T aus, so dass als Verbindung Ampicillin verbleibt, um die grundlegenden Unterschiede zu erklären.

Bei der anschließenden Analyse der klinischen Daten wurde diese Vermutung bestätigt. 62 der 63 auffälligen Kinder wurden mit dem Ampicillin behandelt, bei einem Kind war die Datenlage unklar.

Zusammenfassung: Die Untersuchung zeigt, dass alle Kinder denen Ampicillin verabreicht wurde, ohne Zusatzinformationen ermittelt wurden. Diese Validierung zeigt das Potential der statistischen, ungerichteten Analyse des „Metabolischen Fingerabdrucks“.