Identifizierung und Charakterisierung des „Macrophage Capping Proteins“ CapG als putatives Onkogen in Mammakarzinomen

Genomweite Expressionsanalysen ermöglichen die systematische Suche nach Kandidatengenen, die an der Tumorgenese und -progression beteiligt sind. Basierend auf einer umfassenden Datenanalyse von Expressionsdatenbanken mit dem Ziel, in Tumor- und Normalgeweben differentiell exprimierte Gene zu identifizieren, wurden über einen mehrstufigen Selektionsprozess 40 putative tumorassoziierte Kandidatengene identifiziert, die im Rahmen eines Verbundprojekts im Deutschen Humangenomprojekt weitergehend charakterisiert wurden. Die in der „in silico“-Analyse der Expressionsdatenbanken als Tumorsuppressorgen- oder Onkogen-Kandidaten identifizierten Gene wurden durch Expressionsanalysen mittels Cancer-Profiling-Arrays (CPA, Clontech) und durch RT-PCR bestätigt. Ein putatives Onkogen, welches in 54% der untersuchten Mammakarzinome (MC) höher exprimiert wurde als in normalem Brustgewebe, konnte als das der Gelsolin-Proteinfamilie zugehörige „Macrophage-Capping Protein“ (CapG) identifiziert werden.

In der Mammakarzinom-Zelllinie MDA-MB 231 konnte bislang die höchste relative CapG-Expression sowie ein hohes Metastasierungspotenzial im Matrigel-Invasionsassay nachgewiesen werden. Die CapG-Expressionsanalyse in 39 MC zeigte eine deutlich häufigere CapG-Überexpression in metastasierten MC (M+). Diese Befunde führten zu der Hypothese, dass die Überexpression von CapG zu einer Erhöhung der Zellmobilität und invasivem Wachstum beiträgt. Diese Annahme wird auch dadurch gestützt, dass die mittels siRNA erreichte 50–60%-ige Reduktion der CapG-Expression in der MC-Zelllinie MDA-MB 231 mit einer bis zu 40%-igen Reduktion der Zellmobilität im Matrigel-Assay korreliert.

Für weitere funktionelle Untersuchungen wurden drei Peptide aus verschiedenen Domänen des CapG Proteins synthetisiert und „custom anti-peptide antibodies“ generiert. Die Spezifität der polyklonalen Kaninchenseren wurde in Western Blot Analysen gezeigt. Der CapG Proteinnachweis mittels Immunhistochemie an MC und normalem Brustgewebe sowie Western Blots in Tumorzelllinien stimmten mit den Ergebnissen der CapG-Expressionsanalyse (RT-PCR) überein.

Anscheinend hat jedoch nicht nur der Expressionslevel von CapG einen Einfluss auf den invasiven Phänotyp, sondern auch die Lokalisation des Actin bindenden Proteins im Zellkern. Dabei scheint die Lokalisation von CapG im Zellkern von der Phosphorylierung abzuhängen. Der Phosphorylierungsstatus von CapG bei verschiedenen Proben wurde durch Auftrennung der CapG-Varianten mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese und anschließendem Western Blot mit CapG-spezifischen Antikörpern untersucht. Ergebnisse der zwei-dimensionalen Gelelektrophorese lassen vermuten, dass in Karzinom-Zelllinien (Hela, MDA-MB 231) der phosphorylierte Anteil von CapG deutlich höher ist, als in normalen Zellen (MCF-12A).

Der gegenwärtige Kenntnisstand deutet auf eine Beteiligung des CapG Proteins als mögliches Onkogen bei der Metastasierung von Mammakarzinomen. Ansatzpunkte zur Aufklärung der Funktion des CapG Proteins in diesem Prozess sind funktionelle Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen dem invasiven Wachstumsverhalten von Tumorzellen und dem Expressionslevel, dem Phosphorylierungsgrad und der subzellulären Lokalisation des CapG Proteins sowie dessen Interaktion mit Actin, einem wichtigen Baustein des Cytoskeletts und der Kernmatrix.