Mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus humanem Knochenmark differenzieren in vitro und in vivo zu Zellen mit hepatozytären Eigenschaften

Primäre humane Hepatozyten zur Zelltherapie bei Lebererkrankungen stehen nur begrenzt zur Verfügung. Aufgrund ihrer Plastizität und ihres Proliferationspotentials könnten humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus Knochenmark zur Herstellung funktioneller Hepatozyten geeignet sein.

Mononukleäre Zellen aus humanem aldulten Knochenmark wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und die mesenchymalen Stammzellen über Plastikadhärenz selektioniert. Diese Zellen exprimierten kein CD45, CD34 und CD14. Die angereicherten Stammzellfraktionen waren praktisch frei von hämatopoetischen Zellen. Sie zeigten multipotentes (adipogenes und osteogenes) Differenzierungspotenzial. Die hepatozytäre Differenzierung erfolgte durch Zugabe der Wachstumsfaktoren HGF und EGF in das Kulturmedium und wurde mittels Immuncytochemie, Western Blot, RT-PCR und anhand der Aktivierung des hepatozytenspezifischen Phosphoenolpyruvatkinase(PCK1)-Promotors in 4 Tage differenzierten Stammzellen untersucht. Die Harnstoffsynthese und die Fähigkeit zur Speicherung von Kohlenhydraten (PAS-Färbung) dienten als Nachweis für die funktionelle Aktivität der Zellen.

Für Untersuchungen in vivo wurden in Pfp/Rag2-Mäuse nach Teilhepatektomie 14 Tage differenzierte hMSCs transplantiert und die Leber nach 12 Wochen immunhistochemisch untersucht.

Während der Differenzierung verloren die Zellen morphologisch ihren mesenchymalen und nahmen epithelialen Charakter an. Sie exprimierten transient die Progenitorzellmarker Cytokeratin 7 (CK7), Cytokeratin 19 (CK19) und Alpha-Fetoprotein (AFP), während die Expression des Epithelzellmarkers Cytokeratin 18 (CK18) bzw. der leberspezifischen Marker Connexin 32 (CX32), Albumin, Transferrin (TFN), PCK1, Carbamylphosphatsynthetase (CPS) und HepPar1 zunahm. In differenzierten Zellen war die Expression des unter Kontrolle des PCK1-Promotors stehenden rot fluoreszierenden Transgens RFP vergleichbar der in primären humanen Hepatozyten. Die Glycogen- und Harnstoffsyntheserate stiegen im Laufe der Kultur an. Vordifferenzierte hMSCs exprimierten noch 12 Wochen nach Transplantation die hepatozytenspezifischen Marker PCK1 und HepPar 1.

Mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark sind zur hepatozytären Differenzierung befähigt. Damit eignen sich hMSCs als Ausgangsmaterial für die Herstellung von funktionellen Hepatozyten in vitro, die nach Transplantation in einer Empfängerleber funktionell integrieren könnten.

Key words

Stammzellen - hepatozytäre Differenzierung