Ammoniak induziert eine N-Azetyl-D-Glucosaminidierung in kultivierten Rattenastrozyten

Einleitung: Die N-Azetyl-D-Glucosaminidierung (O-GlcNAc) repräsentiert eine kovalente Proteinmodifikation mit regulatorischer Funktion auf Signalkaskaden und Proteinfunktionen (1). Die durch Ammoniak induzierte Zellschwellung korreliert mit einer Erhöhung des intrazellularen Pools an Glutamin und der Bildung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies. Da Glutamin als Stickstoffquelle im Biosynthesepathway von N-Azetylglucosamin dient, haben wir den Effekt von Ammoniak auf die N-Azetyl-D-Glucosaminidierung in kultivierten Astrozyten untersucht.

Methoden: Dot- und Western-Blot, Immunopräzipitation O-GlcNAc modifizierter Proteine, Immunzytochemie

Ergebnisse: Ammoniak induziert zeit- und konzentrationsabhängig die Zunahme O-GlcNAc modifizierter Proteine. Während nach 6h und 24h nur eine schwache Zunahme O-GlcNAc modifizierter Proteine zu beobachten ist, steigt diese nach 72h 5mM NH₄Cl um ca. 500% gegenüber der Kontrolle an. Dot-Blot Analysen zeigten bereits bei 200μmol/l NH₄Cl einen Anstieg O-GlcNAc modifizierter Proteine. O-GlcNAc modifizierte Proteine zeigten sich im Western-Blot insbesondere im Molekulargewichtsbereich zwischen 35- und 250kDa. Die Spezifität der O-GlcNAc Immunoreaktivität wurde verifiziert durch Präinkubation des anti-GlcNAc Antikörpers mit freiem N-Azetylglucosamin. Im Gegensatz zu NH₄Cl und N-Azetylglucosamin induzierten das nicht verstoffwechselbare NH₄Cl Analogon Methylammoniumchlorid, sowie extrazellulär verabreichtes L-Glutamin keine N-Azetyl-D-Glucosaminidierung. Die NH₄Cl induzierte Zunahme O-GlcNAc modifizierter Proteine ist sensitiv gegenüber Superoxiddismutase, Chelatierung intrazellulären Calciums und der Hemmung der Glutamin-Synthetase durch Methionin-Sulfoximine.

Diskussion: Aktuelle Studien belegen einen Zusammenhang zwischen einer Erhöhung der N-Azetyl-D-glucosaminidierung in Folge einer verstärkten mitochondrialen Bildung von Superoxidanionradikal mit direkter Auswirkung auf die Transkription pathophysiologisch relevante Gene (3). Die Identifizierung spezifisch O-GlcNAc modifizierter Proteine und die Analyse der funktionalen Bedeutung für Veränderung von Expression und Aktivität pathophysiologisch relevanter Proteine könnte von Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der hepatischen Enzephalopathie sein.

Literatur: [1] Guinez C, Lemoine J, Michalski JC, Lefebvre T. (2004), Biochem Biophys Res Commun., Jun 18;319(1):21-6. [2] Häussinger D & Schliess F (2005) Neurochem Int., Jul 47(1-2):64-70 [3] Du XL, Edelstein D, Rossetti L, Fantus IG, Goldberg H, Ziyadeh F, Wu J, Brownlee M., (2000) Proc Natl Acad Sci U S A., Oct 24;97(22):12222-6.

Ammoniak - N-Azetyl-D-Glucosaminidierung - Rattenastrozyten - hepatische Enzephalopathie