Cyclin E1-Isoform Δ3/8 konserviert Hepatozyten in G0

Cyclin E1 kontrolliert den Übergang von der G1 zur S-Phase des Zellzyklus. Mittels semi-quantitativer RT-RCR wurde eine neue alternativ gespleißte Isoform der Cyclin E1-mRNA in der Leber von Wildtyp-Mäusen nachgewiesen. Klonierung und Sequenzierung belegten, dass dieser Variante Exon 3 bis 8 (Δ3/8) einschließlich Cyclin-Box und nukleären Lokalisationssignal fehlten. Zur Analyse möglicher Funktionen von Δ3/8 in der Zellzykluskontrolle wurden partielle Hepatektomien (PH) durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass die Expression der Wildtyp-mRNA von Cyclin E1 zwischen 4 und 36h nach PH zunahm, während zugleich die Expression der Δ3/8-Isoform reduziert wurde. Diese Ergebnisse belegen, dass der G0-G1-Übergang von Hepatozyten durch eine Verschiebung der Expression von der Δ3/8-Variante zur Wildtyp-mRNA gekennzeichnet ist. Die transiente Transfektion von Δ3/8 in NIH/3T3-Zellen und anschließende Western Blot-Analyse ergaben, dass ein Δ3/8-Protein mit einem Molekulargewicht von 27kD translatiert wird, das im Koimmunoprezipitations-Versuch noch in der Lage war cdk2 zu binden. Die entstehenden Δ3/8-cdk2-Komplexe hatten aber die Fähigkeit verloren, Histon H1 im Kinase-Assay zu phosphorylieren. Die Expression eines Δ3/8-EGFP-Fusionsproteins in Huh7-Zellen bestätigte die zytoplasmatische Lokalisation des Δ3/8-Proteins im Vergleich zum nukleären Cyclin E1 Wildtyp-Protein. In nicht proliferierenden Hepatozyten gelang außerdem durch Immun-fluoreszenz der Nachweis der zytoplasmatischen Lokalisation von cdk2. Diese Daten legten den Schluss nahe, dass die Δ3/8-Isoform eine dominant-negative Funktion in der Zellzykluskontrolle durch Fällung und Inaktivierung von cdk2 im Zytoplasma besitzt. Zur Bestätigung dieser Annahme wurden stabil transfizierte NIH/3T3-Zellinien etabliert. Vergleichende FACS-Analysen dieser Zelllinien zeigten, dass die Überexpression von Δ3/8 zu einer Verzögerung des Wiedereintritts von Zellen in den Zellzyklus nach Serumentzug führte. Diese Befunde belegen, dass die murine Cyclin E1-Spleißvariante Δ3/8 bevorzugt in G0-Hepatozyten exprimiert wird und die Überexpression einen dominant-nagativen Einfluss auf den Wiedereintritt in den Zellzyklus ausübt. ˇ

Keywords: Cyclin E1, G0, Hepatozyten