Fragestellung: Die Behandlung boviner pulmonalarterieller Endothelzellen (bPAEC) mit Lipopolysaccharid (LPS) und Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) führt zu einer verstärkten NO-Produktion, die durch eine erhöhte Expression von induzierbarer NO Synthase (iNOS) und endothelialer NO Synthase (eNOS) bedingt ist (Nelin et al. AJP 2001). Der Einsatz von „small interfering RNA“ (siRNA) kann eine vermehrte Protein-Neosynthese selektiv blockieren.
Ist die vermehrte NO-Produktion in bPAEC nach Behandlung mit LPS und TNF-α bedingt durch eine erhöhte iNOS Expression?
Methodik: SiRNA – aus 19 Basenpaaren (GTGAGTTGAAGACTGAGAC) bestehend – wurde hergestellt und mit Restriktionsstellen für SalI und SbaI versehen. Nach Ligierung mit einem kommerziell erhältlichen Vektor wurden E. coli Zellen transformiert und ein selektives Wachstum plasmidhaltiger Zellen induziert. BPAEC wurden dann mit dem Vektor transfiziert mittels Effectene. Nach 3 Tagen wurden bPAEC entweder mit LPS/TNF-α behandelt oder dienten als Kontrolle, und transfizierte bPAEC wurden mit LPS/TNF-α inkubiert über 24h. Der Überstand wurde abpipettiert, die Zellen wurden zur Protein- oder RNA Bestimmung gewonnen.
Ergebnisse: INOS-mRNA wurde nur in LPS/TNF-α behandelten bPAEC gefunden, in Kontrollen oder siRNA transfizierten bPAEC wurden keine iNOS Banden gefunden (RT-PCR). Nitritkonzentrationen waren in LPS/TNF-α behandelten bPAEC höher als in Kontrollen (2,11±0,19µM LPS/TNF-α vs. 1,51±0,07µM Kontrolle, p<0,05). INOS siRNA verhinderte den LPS/TNF-α induzierten Anstieg der Nitrit Konzentration (1,53±0,13µM). LPS/TNF-α Behandlung resultierte in höheren iNOS Protein Werten (Western Blotting) als in Kontrollen (iNOS/β-Actin Quotient: 1,90±0,32 LPS/TNF-α vs. 0,83±0,08 Kontrollen, p<0,05). INOS siRNA verhinderte den LPS/TNF-α induzierten Anstieg der iNOS Protein Werte (iNOS/β-Actin Quotient: 0,99±0,28).
Schlussfolgerung: Die erhöhte NO Produktion ist in LPS/TNF-α behandelten bPAEC weitgehend auf eine erhöhte iNOS Expression zurückzuführen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Entwicklung selektiver iNOS Blocker für die Behandlung inflammatorischer Lungenerkrankungen bedeutsam sein könnte. Dadurch könnte möglicherweise die durch iNOS induzierte NO Bildung verhindert werden, die zu Zytotoxizität führt, während die durch eNOS induzierte NO Produktion den normalen Blutfluss aufrechterhält.
