Einfluss von Estradiol (E2) and Progesteron (P) auf den Natriumtransport alveolar-epithelialer Zellen

Fragestellung: Der alveolär-epitheliale Na+-Transport ist für die postnatale Adaptation und die Überlebenschancen beim akuten Atemnotsyndrom von wesentlicher Bedeutung, und könnte durch E2 and P stimulierbar sein. Ziel der Untersuchungen war, die Wirkungen von E2 und P auf die Aktivität des epithelialen Na+-Kanales (ENaC) und die Na,K-ATPase in kultivierten alveolär-epithelialen Zellen zu untersuchen.

Methodik: Alveolär epitheliale Zellen wurden von Rattenfeten mit einem Gestationsalter von 18–20 Tagen isoliert und auf Polycarbonatfiltern zu konfluenten und hochohmigen Monolayern gezüchtet. Verwendet wurde serumfreies Medium, teilweise supplementiert mit E2 (3.7–10 nmol/l) und P (0.1–2.8µmol/l). Der transepitheliale Kurzschlussstrom (ISC) wurde in Ussing-Kammern gemessen. Die Aktivität von ENaC und Na,K-ATPase wurde durch Blockierungsversuche mit Amilorid und Ouabain untersucht. Durch Permeabilisierung der apikalen und basolateralen Membran wurde die maximale Aktivität von Na,K-ATPase und ENaC ermittelt. Die Leitfähigkeit und Öffnungswahrscheinlichkeit einzelner ENaC wurde durch Patch Clamp Experimente, und die Expression der Untereinheiten von ENaC and Na,K-ATPase mit Western Blots untersucht.

Ergebnisse: E2 and P im Kulturmedium führten zu einer dosisabhängigen Steigerung des ISC (µA/cm2) von 10.05±1.53 auf 12.09±2.58 (p<0.05, ANOVA). Der Amilorid-sensitive ISC, ein Maß für die Aktivität des ENaC, stieg von 7.72±1.32 auf 9.87±1.88 (p<0.05) und der Ouabain-sensitive ISC, ein Maß für die Aktivität der Na,K-ATPase von 8.10±1.41 auf 10.24±1.92 (p<0.05). Der Ouabain-sensitive ISC bei permeabilisierter apikaler Membran, ein Maß für die maximal verfügbare Na,K-ATPase Aktivität, stieg von 12.76±3.75 auf 17.06±4.64 (p<0.05). Alle drei ENaC-Untereinheiten, alpha, beta, und gamma, wurden in Western Blots gefunden, aber eine veränderte Expression war nicht erkennbar. Die Expression der beta1 Untereinheit der Na,K-ATPase schien durch E2 und P herunterreguliert zu werden. Patch clamp Experimente an A549 Zellen nach Kultur mit oder ohne E2 und P zeigten Na+-Kanäle mit einer Leitfähigkeit von 20pS, konsistent mit ENaC, die vorwiegend aus α-Untereinheiten bestehen. Die Öffnungswahrscheinlichkeit lag zwischen 0.002 to 0.63 (median 0.039).

Schlussfolgerungen: Die Supplementierung des Kulturmediums mit E2 und P in physiologischen Konzentrationen steigerte den epithelialen Na+-Transport in alveolären Zellen durch erhöhte Aktivität von ENaC und Na,K-ATPase, aber nicht die Expression der beteiligten Proteine.