Etablierung einer Technik zur Quantifizierung von Superoxid an isoliert perfundierten Mauslungen mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in biologischen Systemen. Zum einen können sie schädigende Wirkungen haben, zum anderen konnte gezeigt werden, dass ROS als Signalmoleküle eine nicht zu unterschätzende Bedeutung haben. So wird ihnen z. B. für den Prozess der hypoxischen pulmonalen Vasokonstríktion (HPV) eine Mediatorfunktion zugesprochen, wobei allerdings nach wie vor unklar ist, ob es unter Hypoxie zu einem Anstieg oder einem Abfall in der Produktion von ROS kommt. Widersprüchliche Daten zur Sauerstoffradikalfreisetzung der Lunge könnten darauf beruhen, dass einige der bisher angewendeten Nachweismethoden zur Quantifizierung von ROS methodisch unzuverlässig sind. Aus diesem Grund haben wir eine Technik zur Quantifizierung von ROS mittels Elektronspinresonanz -Spektroskopie an isoliert perfundierten Lungen etabliert.

Mit der Elektronenspinresonanz-Spektroskopie lässt sich die Sauerstoffradikalbildung durch Perfusion der Lungen mit der Membran-impermeablen „spinprobe“ 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin (CPH) quantifizieren. CPH reagiert mit ROS-Molekülen, wobei das Nitroxid-Radikal 3-carboxy-proxyl (CP^·) entsteht. Dieses, im Vergleich zu ROS relativ langlebige Radikal, lässt sich mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie nachweisen. Die Rate an umgesetzten CPH zu CP^· ist dabei proportional zur gebildeten ROS-Menge. Durch vergleichende Experimente unter Perfusion der Lungen mit Superoxiddismutase kann die intravaskuläre Superoxid-Freisetzung quantifiziert werden.

In unseren vorausgehenden Versuchen an isolierten Kaninchenlungen konnten wir nachweisen, dass die Phorbolmyristatacetat-stimulierte Superoxid-Freisetzung in der Lunge abhängig von der inspiratorischen Sauerstoffkonzentration ist, mit einer maximalen Freisetzung unter Hypoxie (5 % O₂). Ziel war, auf Basis unserer vorausgehenden Experimente, die Elektronenspinresonanz-Technologie nun an die isoliert perfundierte und ventilierte Mauslunge zu adaptieren, um für weiterführende Untersuchungen die Quelle der intravasalen Superoxid-Freisetzung durch die Charakterisierung genetisch veränderter Mäuse vornehmen zu können.

Wir konnten zeigen, dass auch unter Perfusion isoliert ventilierter Mauslungen eine Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie möglich ist. Im Vergleich zu der isolierten Kaninchenlunge setzten isolierte Mauslungen bereits unter basalen Bedingungen reaktive Sauerstoffspezies frei. Die Elektronenspinresonanz-Technik ermöglicht es nun, die Quelle der intravasalen ROS-Freisetzung unter verschiedenen physiologischen sowie pathophysiologischen Bedingungen (z. B. akute und chronische alveoläre Hypoxie), durch die Untersuchung von knockout und transgenen Mäusen zu detektieren.