Hinweise auf eine Beteiligung von Cathepsinen an der kälteinduzierten Apoptose des Hepatozyten

Einleitung: In früheren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass Kaltinkubation in Zellkulturmedium (L–15), Krebs- Henseleit- Puffer (KH) oder University of Wisconsin-Lösung in Hepatozyten eine massive Apoptose auslöst (FASEB J 13: 155–168, 1999, und 14: 1953–1964, 2000; Hepatology 35: 560–567, 2002, und Free Radic Biol Med 35: 1664–1678, 2003). In allen Lösungen war der überwiegende Teil der kälteinduzierten Schädigung über einen Anstieg des zellulären chelatisierbaren Eisenpools, nachfolgende Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und einen mitochondrialen Permeabilitätsübergang vermittelt, in KH und L –15 trat jedoch bei Wiedererwärmung zusätzlich eine eisenunabhängige Komponente der Schädigung zutage, die wir hier untersuchen. Methodik: Kultivierte Rattenhepatozyten wurden bei 4°C in L–15, KH oder natriumfreiem KH (Ersatz durch Cholin) in An- und Abwesenheit des Eisenchelators 2,2'-Dipyridyl oder verschiedener Proteaseinhibitoren inkubiert und anschließend wiedererwärmt. Die Zellschädigung wurde über die Freisetzung von Lactatdehydrogenase, die Aktivitäten verschiedener Proteasen über Fluorophor-markierte Peptidsubstrate bestimmt. Ergebnisse: Auch die eisenunabhängige Komponente der kälteinduzierten Schädigung erwies sich als unabhängig von der extrazellulären Natriumkonzentration, wurde jedoch durch die Serin- und Cysteinproteaseinhibitoren TLCK und Leupeptin gehemmt. Einsatz spezifischerer Inhibitoren ergab eine Hemmung dieser Schädigungskomponente durch die Inhibitoren CA–074-ME und z-FA.fmk, relativ spezifische Inhibitoren der Cathepsine B und L. Der Schutzeffekt zeigte sich dabei nur, wenn die stärkere eisenabhängige Komponente der Schädigung durch einen Eisenchelator unterdrückt wurde (LDH-Freisetzung nach 24h 4°C/3h 37°C: 89±3% in L–15, 50±15% in L–15 + 100µM 2,2'-Dipyridyl, 84±4% in L–15 + 10µM z-FA.fmk und 17±5% in L–15 + 100µM 2,2'-Dipyridyl + 10µM z-FA.fmk). Bestimmung der Proteaseaktivitäten ergab, dass es während der Kaltinkubation weniger zu einer Aktivierung als vielmehr zu einer intrazellulären Umverteilung von Cathepsin B und L kommt. Diskussion: Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass auch die eisenunabhängige Komponente der Kälteschädigung des Hepatozyten nicht dem klassischen Mechanismus einer natriumabhängigen Kälteschädigung entspricht, sondern über Proteasen, vermutlich Cathepsin B, vermittelt wird.

Key words

Apoptose - Kälte - Proteasen