Hypermethylierung von Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors SP1 im Caspase–8 Promoter unterdrücken die Caspase–8 Expression in hepatozellulären Karzinomen der Maus

Hintergrund/Einleitung: Caspase–8 steht am Anfang einer Caspase-Kaskade und ist für die Auslösung von Apoptose durch FasL, TNF etc. von Bedeutung. Wir haben den humanen Caspase–8 Promoter charakterisiert und konnten zeigen, dass basale Caspase–8 Aktivität vor allem über den Transkriptionsfaktor SP1 vermittelt wird und eine zusätzliche Stimulation des Promoters über einen p53-abhängigen Mechanismus möglich ist.

Zielsetzung: Da bekannt ist, dass das hepatozelluläre Karzinom (HCC) häufig mit Mutationen des p53 Gens assoziiert ist, sollte im Rahmen dieser Studie die Expression von Caspase–8 in murinen HCCs untersucht werden.

Ergebnisse: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir c-myc bzw. IgEGF transgene Mausstämme. Diese Tiere entwickeln in 6–12 Monaten HCCs. Aus HCC Knoten wurde RNA isoliert und mittels RT-PCR auf Caspase–8 Expression untersucht. In 46% der untersuchten Tumoren konnte keine Caspase–8 Expression nachgewiesen werden, während in Kontrollebern Caspase–8 exprimiert wird. Wir konnten nachweisen, dass in Tumoren ohne Caspase–8 Expression eine Hypermethylierung von CpG Dinukleotiden im Caspase–8 Promoter vorliegt. Insbesondere sind zwei hypermethylierte Bereiche mit Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor SP1 identisch. Wir zeigten die Relevanz der SP1-Bindungsstellen für die Caspase–8 Promoteraktivität durch Gelshift-Analysen und Luziferase-Reporterexperimente. Durch Verwendung methylierter Oligonukleotide konnten wir weiterhin nachweisen, dass eine Methylierung der SP1 Bindungsstellen im Caspase–8 Promoter eine Interaktion mit SP1 inhibiert und dadurch die basale Promoteraktivität reduziert. Zusätzlich methylierten wir den Caspase–8 Promoter in vitro unter Verwendung des Enzyms CpG-Methylase und zeigten, dass ein methyliertes Promoter-Luciferase Reporterkonstrukt eine dramatische Reduktion der Promoteraktivität aufweist.

Zusammenfassung: Caspase–8 wird in etwa 50% der untersuchten HCCs nicht mehr exprimiert. Der Caspase–8 Promoter ist in diesen HCCs hypermethyliert. Dadurch wird der essentielle Transkriptionsfaktor SP1 nicht mehr gebunden, so dass die basale Expression von Caspase–8 reprimiert wird.

Key words

Apoptose - Caspase-8 - HCC - Methylierung