Entwicklung eines Coexpressionssystems für DRA (down regulated in adenoma) und die PDZ-Adapterproteine E3KARP, EBP50, PDZK1 und CAL

DRA (down regulated in adenoma) ist ein intestinaler Anionenaustauscher mit einem C-terminalen PDZ-Interaktionsmotiv (ETKF). Diese Sequenz vermittelt in vitro die Interaktion mit den PDZ-Adapterproteinen E3KARP, EBP50 und PDZK1 sowie eventuell CAL. Die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion ist nicht bekannt. Anhand der Interaktion anderer Membrantransporter mit PDZ-Adapterproteinen scheint ein Einfluss auf die Regulation und/oder auf die Expression in der Plasmamembran möglich. Ziel: Entwicklung eines Systems für die Coexpression von DRA (konstitutiv) und die verschiedenen PDZ-Adapterproteine (induzierbar). Hieran soll der Einfluss der PDZ-Adapterproteine auf die DRA-Funktion und Expression untersucht werden. Methodik: Ein EGFP-DRA Fusionskonstrukt wurde in EcR-Zellen konstitutiv exprimiert. Diese Zellen ermöglichen die induzierbare Expression mittels Ecdyson.. EcR293/EGFP-DRA-Zellen wurden zusätzlich mit einem induzierbaren DSRed2-EBP50-Fusionskonstrukt transfiziert, DSRed2 diente als Positivkontrolle. Der DRA-vermittelte Cl/HCO₃-Austausch wurde mit dem pH_i-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF gemessen. Die Expression der DSRed2-Konstrukte wurde anhand ihrer Eigenfluoreszenz erfasst. Die in der Plasmamembran exprimierte DRA-Fraktion wurde durch Oberflächenbiotinylierung bestimmt. Ergebnisse: EcR293/EGFP-DRA-Zellen weisen einen ca 8-fach über dem Background liegenden Cl/HCO₃-Austausch auf. Dabei sind mittels Biotinylierung weniger als 10% der EGFP-DRA-Gesamtmenge in der Plasmamembran nachzuweisen. Diese Zellen exprimieren endogen EBP50, jedoch kein E3KARP, die Expression von PDZK1 und CAL ist noch unbekannt. DSRed2 kann in diesen Zellen mittels 5µM Ponasteron (Ecdyson-Analogon) stark induziert werden. EBP50 lässt sich ebenfalls als DSRed2-Fusionskonstrukt induzieren, jedoch in geringerem Maße. Die Transfektion von E3KARP, PDZK1 und CAL ist geplant. Zusammenfassung und Schlussfolgerung: Das beschriebene System ermöglicht die Coexpression von DRA als EGFP-Fusionsportein und EBP50 als DSRed2-Fusionsprotein und bietet sich daher für funktionelle Untersuchungen der Interaktion von DRA mit PDZ-Adapterproteinen anhand der DRA-Aktivität, der DRA-Oberflächenexpression und der Colokalisation von DRA und den verschiedenen PDZ-Adapterproteinen an.

CAL - DRA - E3KARP - EBP50 - NaCl-Resorption - PDZ-Adapterproteine - PDZK1