Transporteigenschaften von DRA (down regulated in adenoma) in transfizierten HEK293 Zellen

DRA (down regulated in adenoma) ist ein intestinaler Anionenaustauscher, der –zusammen mit dem Na/H Austauscher NHE3– die elektroneutrale NaCl Resorption im Ileum und proximalen Colon vermittelt. Die Transportcharakteristika von DRA werden kontrovers diskutiert. Ziel: Charakterisierung der Transporteigenschaften von DRA in einem heterologen, humanen Expressionssystem (HEK293 Zellen). Methoden: DRA wurde als N-terminal EGFP-getaggtes Fusionsprotein in HEK293 Zellen exprimiert. Die Expression wurde mittels RT-PCR, Western Blot und EGFP-Fluoreszenz bestätigt. DRA-vermittelte Veränderungen des intrazellulären pH (pH_i) und des intrazellulären Chlorid ([Cl]_i) wurden mit den Flusoreszenzfarbstoffen BCECF und MQAE erfasst. Die Expression von CFTR, AE1 und AE2 wurde mittels RT-PCR getestet. Ergebnisse: Nicht-transfizierte HEK293 Zellen besitzen nur eine geringe Cl/HCO₃-Austausch-Aktivität. DRA vermittelt Cl/HCO₃-Austausch aber OH^- wird nicht oder nur sehr schlecht transportiert. Sulfat wird weder transportiert noch bindet es an DRA. In transfizierten Zellen ist der Transport von Chlorid nahezu vollständig abhängig von CO₂/HCO₃. Die Chlorid-Affinität von DRA liegt zwschen 23 and 36 mM. Depolarisation hat keinen Effekt auf den DRA-vermittelten Cl/HCO₃-Austausch. Weder transfizierte noch nicht-transfizierte HEK293 Zellen exprimieren CFTR, AE1 oder AE2. 4 mM DIDS inhibiert DRA nur zu 55±11%, die k_0.5 dieses Effektes liegt bei 1 mM. 50µM Tenidap (Pfizer) inhibiert DRA zu 71±8%. Unerwarteterweise inhibiert 100µM Glibenclamid DRA: 59±22% Inhibition des HCO₃-Transports und 79±3% des Cl-Transports. Die Effekte von DIDS und Tenidap sind nicht additiv zu dem von Glibenclamid. Schlussfolgerung: In transfizierten HEK293 Zellen ist DRA der bedeutendste Anionenaustauscher. Humanes DRA vermittelt elektroneutralen Cl/HCO₃-Austausch. Die Cl-Affinität von humanem DRA in transfizierten HEK293 Zellen ist höher als an Kaninchen brush-border-Membranen und an injizierten Oocyten beschrieben (jeweils ca 5 mM). Dies lässt eine Regulation der Chlorid-Affinität möglich erscheinen. DRA ist relativ DIDS-resistent, kann jedoch durch Tenidap und Glibenclamid gehemmt werden. Die Funktion von DRA ist nicht an die Expression von CFTR, AE1 oder AE2 gebunden.

Schlüsselwörter

Colon - DRA - Ileum - NaCl-Resorption