Zusammenfassung
Fragestellung: Das Ki-67-Antigen wird nur in proliferierenden Zellen exprimiert. In vorausgegangenen
Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass gegen das Ki-67-Antigen gerichtete Antisense
Oligonukleotide (asON) die Tumorzellproliferation und das Tumorwachstum in vitro und
in subkutanen Harnblasen- und Prostatatumor-Modellen spezifisch hemmen können. In
dieser Studie sollte die Effektivität dieses therapeutischen Ansatzes in 2 Nierenzelltumor-Modellen
evaluiert werden. Material und Methode: Humane Nierenkarzinom (NZK)-Zellen (SK-RC 35) wurden zunächst mit FITC-markierten
ON und verschiedenen kationischen Lipiden transfiziert, um die Transfektionseffizienz
durchflusszytometrisch (FACS) zu bestimmen. Durch quantitative RT-PCR wurde die Potenz
von 14 verschiedenen ON-Sequenzen gegen das Ki-67-Antigen in vitro verglichen. Der
Einfluss des effektivsten Konstrukts auf die Zellproliferation wurde in Monolayer-Zellkultur
durch Zellzählung ermittelt. Für In-vivo-Versuche wurden asON als auch Kontroll-ON
im orthotopen immunkompetenten NZK-Modell (RENCA) bei Balb/c-Mäusen sowie im immundefizienten
NZK-SCID-Mausmodell intraperitoneal appliziert. Tumorgrößen wie auch abschließende
Tumorgewichte wurden dokumentiert. Überdies wurden verschiedene immunhistochemische
Färbungen durchgeführt. Ergebnisse: FACS-Messungen zeigen hoch effektive Transfektionsbedingungen in vitro. Sowohl in
RENCA- als auch SK-RC 35-Zellkultur bewirkten asON eine deutliche Proliferationshemmung.
Die systemische Gabe von asON führte zu einer signifikanten Tumorwachstumshemmung
sowohl im RENCA-Modell (p < 0,05) als auch im SCID-Mausmodell (p = 0,009). Immunhistochemische
Färbungen der Tumoren zeigten eine deutliche Zielprotein-Hemmung wie auch eine gering
erhöhte Apoptoserate nach Antisense-Behandlung, während die Gefäßdichte nicht signifikant
beeinträchtigt wurde. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das Ki-67-Antigen ein geeignetes antiproliferatives
Target ist und dass Antisense-Oligonukleotide gegen dieses Target einen potenten Wirkstoff
darstellen, der eine signifikante Wachstumshemmung bei Nierenzelltumoren in unterschiedlichen
Mausmodellen induziert.
Abstract
Purpose: The Ki-67 antigen is only expressed in proliferating cells. Previously, it was shown
that Ki-67 derived antisense oligonucleotides (asONs) specifically inhibit the proliferation
of tumor cells and tumour growth in vitro and in subcutaneous bladder and prostate
tumor models. We intended to evaluate the effects of this therapeutic concept in two
renal cell carcinoma (RCC) models. Material and Methods: Human RCC cells (SK-RC 35) were initially transfected with FITC-labeled ONs and diffferent
cationic lipids to analyze the transfection efficacy by flow cytometry (FACS). The
potency of 14 different ONs sequences was compared by quantitative RT-PCR in vitro.
For in vivo testing, ONs were administered to immunocompetent Balb/c mice bearing
orthotopic RENCA tumors as well as to SCID mice bearing subcutaneous RCC SK-RC 35
xenografts. Tumor sizes and final tumor weights were documented. Additionally, several
immunohistochemical staining procedures were performed. Results: FACS analysis showed highly effective transfection conditions in vitro. Systemic
administration of asONs significantly decreased the tumour growth in the RENCA model
(p < 0.05) and in the SCID mouse model (p = 0.009). Immunohistochemical staining of
tumor specimens revealed a marked down-regulation of target protein and a slight increase
in apoptotic cells after antisense treatment while the microvessel count was not significantly
altered. Conclusion: These results demonstrate that the Ki-67 antigen represents a suitable antiproliferative
target and that asONs directed against this target are potent drugs that induce a
significant inhibition of renal tumor growth in different mouse models.
Schlüsselwörter
Antisense - Oligonukleotide - Ki-67 - Proliferation - Nierenzellkarzinom
Key words
Antisense - oligonucleotides - Ki-67 - proliferation - renal cell carcinoma
Literatur
- 1
Cooper S R, Taylor J K, Miraglia L J, Dean N M.
Pharmacology of antisense oligonucleotide inhibitors of protein expression.
Pharmacol Ther.
1999;
82
427-435
- 2
Delahunt B, Bethwaite P B, Thornton A, Ribas J L.
Proliferation of renal cell carcinoma assessed by fixation-resistant polyclonal Ki-67
labeling.
Cancer.
1995;
75
2714-2719
- 3
Drevs J, Hofmann I, Hugenschmidt H. et al .
Effects of PTK787/ZK 222 584, a specific inhibitor of vascular endothelial growth
factor receptor tyrosine kinases, on primary tumor, metastasis, vessel density, and
blood flow in a murine renal cell carcinoma model.
Cancer Res.
2000;
60
4819-4824
- 4
Ebert T, Bander N H, Finstad C L, Ramsawak D, Old L J.
Establishment and characterization of human renal cancer and normal kidney cell lines.
Cancer Res.
1990;
50
5531-5536
- 5
Endl E, Gerdes J.
The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function.
Exp Cell Res.
2000;
257
231-237
- 6
Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker H H, Schwab U, Stein H.
Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined
by the monoclonal antibody Ki-67.
J Immunol.
1984;
133
1710-1715
- 7
Hillman G G, Droz J, Haas G H.
Experimental animal models for the study of therapeutic approaches in renal cell carcinoma.
In Vivo.
1994;
8
77-80
- 8
Kausch I, Böhle A.
Antisense oligonucleotide therapy in urology.
J Urol.
2002;
168
239-247
- 9
Kausch I, Böhle A.
Molecular aspects of bladder cancer III. Prognostic Markers of Bladder Cancer.
Eur Urol.
2002;
41
15-29
- 10
Kausch I, Böhle A.
Grundlagen der Antisense-Oligonukleotid Therapie und derzeitige Therapiestrategien
in der Urologie.
Aktuelle Urologie.
2003;
34
458-468
- 11
Kausch I, Lingnau A, Endl E. et al .
Antisense treatment against the Ki-67-mRNA inhibits proliferation and tumour growth
in vitro and in vivo.
Int J Cancer.
2003;
105
710-716
- 12
Kausch I, Jiang H, Brocks C. et al .
Ki-67-directed antisense therapy in an orthotopic renal cell carcinoma model.
Eur Urol.
2004;
46
118-124
- 13
Kausch I, Jiang H, Eberdwalbesloh N, Doehn C, Krüger S, Sczakiel G, Jocham D.
Inhibition of Ki-67 in a renal cell carcinoma SCID mouse model is associated with
induction of apoptosis and tumour growth inhibition.
Br J Urol.
2005;
95
416-420
- 14
Levin A A.
A review of issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense
oligonucleotides.
Biochimica et Biophysica Acta.
1999;
1489
69-83
- 15
Rioux-Leclercq N, Turlin B, Bansard J Y. et al .
Value of immunohistochemical Ki-67 and p53 determinations as predictive factors of
outcome in renal cell carcinoma.
Urology.
2000;
55
501-505
- 16
Scholzen T, Endl E, Wohlenberg C, DerSar S van, Cowell I G, Gerdes J, Singh P B.
The Ki-67 protein interacts with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family:
a potential role in the regulation of higher-order chromatin structure.
J Pathol.
2002;
196
135-144
- 17
Scholzen T, Gerdes J.
The Ki-67 protein: from the known and the unknown.
J Cell Physiol.
2000;
182
311-322
- 18
Visapaä H, Bui M, Huang Y. et al .
Correlation of Ki-67 and gelsolin expression to clinical outcome in renal clear cell
carcinoma.
Urology.
2003;
61
845-850
Oberarzt Dr. med. Ingo Kausch
Klinik für Urologie · Universitätsklinik Schleswig-Holstein · Campus Lübeck
Ratzeburger Allee 160
23538 Lübeck
Phone: 0451-500-6113 ·
Fax: 0451-500-4666
Email: IKausch@aol.com