Genexpressionsanalyse an Tiermodellen des akuten neonatalen Lungenversagens: Evaluation dreier potentieller Housekeeping-Gene für die Real-Time PCR

Fragestellung:

Zur quantitativen mRNA-Bestimmung hat sich die Real-Time PCR als eine sensitive und präzise Methode etabliert. Die Untersuchungen molekularbiologischer Veränderungen im Rahmen verschiedener Tiermodelle zum akuten neonatalen Lungenversagen erfordern die Analyse der Genexpression mittels Real-Time PCR. Die Methode erfordert den Bezug auf ein Housekeeping-Gen, das in allen Proben möglichst konstant exprimiert sein muss. Somit hängt die Validität dieser Methode entscheidend von der Auswahl des Housekeeping-Genes in dem entsprechenden Modell ab. Es wurde daher die pulmonale Expression von drei häufig verwendeten Housekeeping-Genen untersucht.

Methodik:

Bei 67 neugeborenen Ferkeln verschiedener Versuchsgruppen wurde pulmonales Gewebe gewonnen: a) Induktion eines Mekoniumaspirationssyndroms (MAS) durch intratracheale (i.t.) Applikation von 20% Mekonium (5ml/kg Körpergewicht) unter maschineller Beatmung mit anschließender i.t. Verabreichung von i) rekombinantem SP-C (rSP-C) Surfactant (SF), ii) natürlichem SF (nat. SF) oder iii) NaCl; b) Untersuchung des Einflusses von Östradiol (E2) oder Progesteron (P) auf die Lungenreifung in einer i) Behandlungsgruppe nach intrauteriner intramuskulärer Injektion eines E2- und eines P-Rezeptorblockers sowie in einer ii) unbehandelten Placebogruppe. Mittels Real-Time PCR wurde die Expression der potentiellen Housekeeping-Gene 18S, Beta-Actin und HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) im Homogenat der Lungenbiopsien quantifiziert und auf die Menge der gesamt-RNA Konzentration der Probe bezogen.

Ergebnisse:

Die Gene unterschieden sich nicht signifikant in ihrer mittleren Expression zwischen den einzelnen Versuchsgruppen. Als Maß für die Schwankungsbreite (SB) der Genexpression in den einzelnen Gruppen dient der Faktor, um den sich der jeweils höchste und der niedrigste Wert unterscheiden.

	18S	Beta-Actin	HPRT
MAS, rSP-C	3,0	172,4	346,5
MAS, nat. SF	1,9	16,6	86,4
MAS, NaCl	2,7	18,8	11,6
E2- und P-Rezeptorblocker	4,6	38,5	12,9
Placebogruppe	4,2	4,5	5,4

Für Beta-Actin und HPRT zeigte sich in mehreren Behandlungsgruppen ein Anstieg der SB, während diese bei 18S in allen Gruppen nahe dem theoretischen Idealwert von 1 lag.

Schlussfolgerungen:

Für die untersuchten Tiermodelle zum akuten neonatalen Lungenversagen erwies sich 18S als das geeignete Housekeeping-Gen, da hier die Schwankungsbreite innerhalb der Versuchsgruppen am geringsten war. Die häufig als Referenz verwendeten Gene Beta-Actin und HPRT können durch ihre Schwankung zu einer Einschränkung der Qualität oder der Aussagekraft der resultierenden Daten führen. Von der oft unkritisch vorgenommenen Verwendung nicht validierter Housekeeping-Gene muss somit abgeraten werden.