Bestimmung der Rhesus-D Zygotie: Eine Methode zur RHD Merkmalsbestimung in Familien mit Risikokonstellation

Einleitung: Frauen mit irregulären Anti-D Antikörpern nach einer Schwangerschaft besitzen bei weiteren Schwangerschaften mit demselben Kindsvater ein hohes Risiko zur Ausbildung einer fetalen Erythroblastose. Für Männer mit einem RHD-positiven Haplotyp beträgt das Risiko 50% zu einer Erythroblastose beizutragen, bei Männern mit zwei RHD-positiven Haplotypen ist praktisch jede weitere Schwangerschaft gefährdet. Mit serologischen Techniken ist eine immunhämatologische Bestimmung des zweiten D-Merkmals nicht möglich. Wir stellen hier eine molekular-genetische Methode vor, mit der eine Untersuchung auf der Ebene der Gensequenzen ermöglicht wird.

Methode: Aus 472 EDTA-antikoagulierten Blutproben (DD, Dd, dd), darunter 72 Nabelschnurblutproben mit gesicherter heterozygoter RHD-Expression (Dd), wurde genomische DNA isoliert. Sequenzen des Exons 3 der RHD und RHCE Gene wurden in einer Multiplex-PCR in Gegenwart von doppel-fluoreszenz-markierten DNA Sonden (Reporter: 5'-FAM [für RHD[/ 5'-TET [für RHCE[ und Quencher: 3'-TAMRA) amplifiziert und die Änderung der Fluoreszenz pro Zyklus bestimmt (quantitative Real-Time-PCR im ABI-Prism SDS7700, Perkin Elmer, Weiterstadt). Die Differenz in der Anzahl der Amplifikationszyklen (gemessen für die halb-maximale Fluoreszenzintensität) zwischen RHD- und RHCE- Proben wurde als δCT -Wert bestimmt.

Ergebnisse: Quantitative Real-Time-PCR ermöglicht die Bestimmung des Rhesus-D Haplotypen-Konstellation unter Verwendung der RHCE-Gene als interner Standard. 328 DNA-Proben konnten in sehr guter Übereinstimmung mit statistischen Verteilungsmustern für RHD-Haplotypen bestimmt werden. Die 72 heterozygoten D- Nabelschnurblutproben und die 72 D-negativen Proben der entsprechenden Mütter konnten exakt bestimmt werden.

Zusammenfassung: Quantitative Real-Time-PCR zur RHD-Haplotypenbestimmung ist eine neue Methode, die sichere Untersuchungsergebnisse liefert. Bei Verwendung von 96er PCR-Platten können 24 Proben (incl. aller Kontrollen) in 150 Minuten amplifiziert und ausgewertet werden. Die Methode kann dadurch einen wesentlichen Beitrag zum Schwangerschaftsmonitoring und zur Risikoabschätzung beitragen.