Entwicklung eines Sandwich-Immunoassays zur Quantifizierung von Phytase aus Aspergillus niger

Hintergrund: Phytase ist ein Enzym, das in der Futtermittelindustrie zur Optimierung der Tierernährung verwendet wird. Sie spaltet in Pflanzen vorkommende Phytinsäure und erhöht damit die Verfügbarkeit von Phytat-Phosphor für monogastrische Tiere (z.B. Schweine und Geflügel). Phytase aus Aspergillus niger besitzt ein hohes allergenes Potential und führte in der enzymverarbeitenden Industrie bei Arbeitern mit Staubexposition zu Sensibilisierungen und Atemwegsbeschwerden.

Ziel des Projektes war die Entwicklung einer Messmethode zur Quantifizierung der Phytase-Belastung der Luft an Arbeitsplätzen.

Durch die Immunisierung eines Kaninchens mit Phytase aus A. niger und TiterMax®Gold als Adjuvans wurde polyklonales Antiserum gewonnen und die spezifischen Antikörper mittels Antigen-Affinitätschromatographie isoliert. Die Antikörper wurden als Fang- bzw. nach Biotinylierung als Nachweisantikörper in einem Sandwich-ELISA eingesetzt. Zur Überprüfung der Spezifität des Immunoassays wurden Extrakte aus Tierfutter und Lyophylisaten folgender Substanzen getestet: A. niger, A. oryzae, A fumigatus, Trichoderma viride, Hefe, Soja, Reis, Weizen-, Roggen-, Gerste- und Haferschrot (alle von Allergon, Schweden).

Resultate: Der Sandwich-Immunoassay detektierte Phytase aus A. niger bei Konzentrationen im Pikogrammbereich. Phytasekonzentrationen von 40 – 625 pg/ml zeigten im Interassayvergleich einen Variationskoeffizienten kleiner 10%. Dieser Konzentrationsbereich wurde als der Messbereich des Immunoassays definiert. Bei der Spezifitätsüberprüfung des Testverfahrens konnte bei folgenden Extrakten in den angegebenen Substanzkonzentrationen keine Reaktivität nachgewiesen werden: A. oryzae (20 mg/ml), A. fumigatus (25 mg/ml), Tierfutter (40 mg/ml), Roggen (30 mg/ml), Weizen (35 mg/ml), Gerste (35 mg/ml) und Reis (30 mg/ml). Eine geringe Reaktivität wiesen der T. viride-Extrakt (ab 6 mg/ml) und die Extrakte aus Hefe (ab 2,5 mg/ml), Soja (ab 15 mg/ml) und Hafer (ab 5 mg/ml) auf. Eine deutliche Reaktion zeigte dagegen der Extrakt aus A. niger; der errechnete Phytasegehalt des Lyohylisats betrug ca. 0,2%.

Schlussfolgerung: Mit einem Messbereich von 40 – 625 pg/ml ist der entwickelte Phytase-Sandwich-ELISA ausreichend sensitiv, um geringe Phytasemengen nachweisen zu können und soll zur Phytase-Quantifizierung in Produkten und Staubproben eingesetzt werden.

*gefördert durch die EU im Rahmen des Projektes MOCALEX, Contrakt No QLK4-CT-2001–00432