HLA-G-Dimerisierung über Disulfid-Brückenbildung auf der Zellmembranoberfläche; KIR2DL4 ist nicht der vermutete HLA-G-Rezeptor

Fragestellung: HLA-G ist ein nicht klassisches MHC-Klasse-I-Molekül, im Wesentlichen exprimiert im extravillösen invadierenden Trophoblasten. Es weist einen eingeschränkten Polymorphismus und eine trunkierte zytoplasmatische Domäne auf. Seine in vivo Struktur, sein physiologischer Rezeptor sowie seine Funktion sind weitgehend unbekannt.

Methodik: HLA-G cDNA wurde aus der JEG-3-Zelllinie kloniert und in E.coli exprimiert, das resultierende HLA-G-Protein dann aufgereinigt und mit β2-Mikroglobulin plus Bindungspeptid in nativ gefaltetes Protein transferiert. Monoklonale Maus-Antikörper wurden generiert sowohl gegen natives als auch gegen denaturiertes HLA-G und ihre Spezifität und Sensitivität in Western Blotting, FACS-Analyse und Immunhistochemie gesichert. HLA-G Mono-/Dimere wurden durch FPLC Gelfiltration, Einsatz von Disulfid-Brücken reduzierenden bzw. blockierenden Agentien sowie durch zielgesteuerte Punktmutationsanalyse charakterisiert. Zur Untersuchung der Bindung an den vermuteten HLA-G-Rezeptor KIR2DL4 wurde dessen Extrazellulärdomäne molekular fusioniert an die CD3ζ-Transmembran-Zytoplasma-Domäne, stabil in BW^-Maus-Thyom-Zelllinie transfiziert, mit 721.221 HLA-G kokultiviert und eine mögliche Aktivierung durch Bindung über IL2-Sekretion gemessen. Zusätzlich wurde zur direkten Bindungsanalyse die Surface-Plasmon-Resonance-Methode eingesetzt.

Ergebnisse: Es konnten mehrere potente monoklonale Maus-Antikörper gegen natives sowie gegen denaturiertes HLA-G generiert werden, welche spezifisch und sensitiv ihr Antigen binden. HLA-G bildet in vitro innerhalb von 3 Wochen bei 4°C zu etwa 75% und in vivo zu nahezu 100% Homodimere, die sich durch den Einsatz von das Redox-Potential positivierenden Reduktionssmitteln zwar voneinander trennen, aber deren Bildung sich mit Carboxy-Methylierungs-Agentien während der Zellysierung allein nicht mehr blockieren lassen, was auf in vivo entstandene Disulfid-Brückenbindung zwischen den HLA-G Dimeren hinweist. Diese Disulfid-Bindung wurde verifiziert am Cystein-Rest an der Aminosäure-Position 47 durch Ausbleiben der Dimerisierung nach zielgesteuerter Punktmutation dieses Cystein-Restes nach Serin. In der Kokultur von BW^-KIR2DL4-ζ Zellen mit 721.221 HLA-G Zellen sowie in der Surface Plasmon Resonance zeigte sich keinerlei Bindung von HLA-G an den KIR2DL4-Rezeptor.

Schlussfolgerung: Unsere neuen monoklonalen Antikörper stellen potente Agentien zur Charakterisierung von HLA-G dar. HLA-G kommt anders als andere MHC-Klasse-I-Moleküle physiologischerweise fast ausschließlich als Homodimer auf der Zelloberfläche vor. Unsere Ergebnisse weisen keinerlei Bindung dieses physiologischen HLA-G Dimers an den vermuteten Rezeptor-Kandidaten KIR2DL4 nach. Damit ist man in der Charakterisierung von HLA-G einen großen Schritt weitergekommen. Zukünftige Experimente werden nach dem tatsächlichen Rezeptor fahnden müssen, um schließlich die Funktion von HLA-G zu entdecken.